الكشف عن G البروتين إلى جانب مستقبلات التعبير في الخلايا العصبية Vagal الماوس Afferent باستخدام Multix في الموقع التهجين
Summary
تم استخدام Multix في التهجين الموقعي (ISH) لتصور النصوص في وقت واحد لمستقبلين مقترنين بالبروتين G وعامل نسخ واحد في مجمع العقدة المبهم بأكمله من الماوس البالغ. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد خرائط دقيقة من ملامح النسخ من الخلايا العصبية المبهمة afferent.
Abstract
تصف هذه الدراسة بروتوكولا للتهجين المتعدد في الموقع (ISH) للجانجليا الوداجية العقيدة الماوسية ، مع التركيز بشكل خاص على الكشف عن التعبير عن مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs). تمت معالجة العقدة الوداجية العقيدات الثابتة بالفورمالين باستخدام تقنية RNAscope للكشف في وقت واحد عن تعبير اثنين من GPCRs التمثيلية (مستقبلات cholecystokinin و ghrelin) بالاشتراك مع جين علامة واحد إما من العقيدات (علبة منزل تشبه الزوج 2b ، Phox2b) أو الخلايا العصبية الأفرنت الوداجية (بروتين إصبع الزنك في مجال PR 12 ، Prdm12). تم تصوير العقدة المسماة باستخدام المجهر confocal لتحديد أنماط التوزيع والتعبير من النصوص المذكورة أعلاه. لفترة وجيزة، تم العثور على الخلايا العصبية Phox2b afferent للتعبير بوفرة مستقبلات cholecystokinin (Cck1r) ولكن ليس مستقبلات غريلين (غسر). تم العثور على مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية Prdm12 afferent أيضا للتعبير عن Ghsr و / أو Cck1r. تتم مناقشة المحاذير التقنية المحتملة في تصميم ومعالجة وتفسير ISH متعددة. النهج الموصوف في هذه المقالة قد يساعد العلماء في توليد خرائط دقيقة للملامح النسخية من الخلايا العصبية المبهمة.
Introduction
وترد جثث الخلايا من afferents المبهم في الوداجي، بتروسال، وggallia نودوز1،2،3. محاورهم السفر معا عبر عدة فروع من العصب المبهم إلى القحف والصدر والبطن الأراضي4،5،6،7. من النهايات الحشوية ، يمكن أن تستجيب الطحالب لمجموعة واسعة من المحفزات الفسيولوجية والمضرة8و9و10. ومع ذلك، فإن توزيع جزيئات الإشارات والمستقبلات المشاركة في الاستشعار عن المبهم لا يزال غير مميز. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العقدة المبهمة ، على الرغم من صغر حجمها ، تعبر عن طيف واسع من المستقبلات ، بما في ذلك عدد كبير من GPCRs8،11،12،13. وعلاوة على ذلك، الخلايا العصبية المبهمة غير متجانسة بطبيعتها وعرض ملامح الجزيئية متميزة14. ولتعقيد الأمر، يتم إرفاق العقدة الوداجية والتروسالية والعقيدة في الماوس، وبالتالي تشكيل كتلة واحدة من العقد. وأخيرا ، في مجموعة فرعية من الحيوانات ، يتم إرفاق العقدة العقيدية إلى العقدة العنقية المتفوقة المتعاطفة15.
في الماضي، تحولت المحققين إلى الكيمياء المناعية لدراسة الماكياج الكيميائي العصبي من الخلايا العصبية المبهمة16،17،18. في حين أن الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة المعتمدة مفيدة ، يجب تفسير نتائج الدراسات الكيميائية المناعية بحذر. على سبيل المثال، فشلت العديد من الجهود لتحديد أجسام مضادة محددة ضد GPCRs19و20و21و22و23و24و25، مما دفع المحققين إلى استنتاج أن غالبية الأجسام المضادة ضد GPCRs لا يمكن الاعتماد عليها. للتحايل على هذه القضايا، وقد استخدمت على نطاق واسع PCR الكمية (qPCR) لتقييم التعبير الجيني في كتلة العصابات المبهم القوارض26،27،28،29. ومع ذلك، فإن فحص التعبير الجيني باستخدام qPCR يحدث على حساب فقدان المعلومات المكانية. ولا يمكن التنبؤ على وجه الخصوص بعدد الخلايا أو نوع الخلية (أنواعها) التي تعبر عن جين معين مهم (مثل الخلايا العقدية مقابل الخلايا الوداجية). وتشمل القضايا المتكررة أيضا التلوث مع الأنسجة المجاورة وإدراج أطوال متغيرة من العصب المبهم، عنق الرحم متفوقة، والغانجيليا الوداجية أثناء تشريح15. نتيجة للصعوبات المذكورة أعلاه، الجدل يحيط التعبير وتوزيع العديد من GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة. أحد الأمثلة المحيرة بشكل خاص يتعلق بمستقبلات غريلين (Ghsr). في حين وجدت بعض الدراسات على نطاق واسع التعبير عن هذا المستقبل في الخلايا العصبية المبهمة30,31,32, وجدت دراسات أخرى أن GHSR مرنا أن تكون غير قابلة للكشف تقريبا في العقدة العقيدات11,14. ولذلك هناك ما يبرر رسم خرائط مفصلة ل Ghsr mRNA في الكتلة الغنغليونية المبهمة.
في الموقع التهجين (ISH) كما تم استخدامها لتقييم أنماط التعبير الجيني في كتلة ganglionic المبهم7،11،12،33،34،35. لأن التقنيات القائمة على الحمض النووي الريبي لا تزال أكثر موثوقية ومحددة من التقنيات القائمة على الأجسام المضادة في معظم الظروف36،37، أثبتت دراسات ISH قيمة لفهم أفضل للترميز الكيميائي العصبي للخلايا العصبية المبهمة. ومع ذلك، فإن تقنيات ISH التقليدية نفسها لا تخلو من المحاذير. المشعة ISH حساسة ولكن يولد الخلفية ويبقىمرهقة 38. ISH غير المشعة أقل تعقيدا ولكن أيضا أقلحساسية 38. في المقابل، فإن طريقة RNAscope ISH المطورة مؤخرا حساسة للغاية وتولد الحد الأدنى من الخلفية39. الدراسة الحالية تطبيق متعدد الفلورسنت RNAscope للكشف عن GPCRs في الخلايا العصبية المبهمة من الماوس. ركزنا على رسم خرائط لتوزيع Ghsr وقارنا توزيعه بمستقبلات المرارة (Cck1r) ، وهو GPCR آخر معروف جيدا ليتم التعبير عنه في العقدة العقيدية34. وأخيرا، تم استخدام اثنين من عوامل النسخ، وقران مثل homeobox 2b (Phox2b) وبروتين إصبع الزنك المجال العلاقات العامة 12 (Prdm12)، كعلامات انتقائية للخلايا العصبية العقيدة والوداجي afferent، على التوالي14. دون تصور Phox2b أو Prdm12 ، سيكون من الصعب تحديد الوداجي مقابل العقيدات مع اليقين. كما تناقش المزالق التقنية المحتملة في جميع أنحاء المقال.
Protocol
Representative Results
Discussion
اخترعت التقنية من ISH في أواخر 1960s42. ومع ذلك، فإنه ليس حتى منتصف 1980s أنه تم تطبيقه للكشف عن mRNAs في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي43،44. وبالنظر إلى عدم تجانس الجهاز العصبي والقضايا المتكررة مع الأجسام المضادة، وتوطين نسخة معينة على المستوى الخلوي ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل التشريح العصبي / الأنسجة / الدماغ حقن الأساسية الممولة من منحة المعاهد القومية للصحة #5P01DK119130-02. الكتاب يود أن يعترف بمساعدة UT جنوب غرب مرفق تصوير الخلايا الحية (برئاسة الدكتور فيلبس) وموظفيها (Abhijit بوغدي ومارسيل Mettlen) ، بدعم جزئي من منحة NIH #1S10OD021684-01 ، وهو مورد مشترك لمركز هارولد سيمونز للسرطان ، بدعم جزئي من منحة دعم مركز السرطان NCI ، P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
