Détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones afférents vagals de souris à l’aide de l’hybridation in situ multiplex
Summary
L’hybridation multiplex in situ (ISH) a été utilisée pour visualiser simultanément les transcriptions de deux récepteurs couplés à la protéine G et d’un facteur de transcription dans l’ensemble du complexe ganglionnaire vagal de la souris adulte. Ce protocole pourrait être utilisé pour générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.
Abstract
Cette étude décrit un protocole pour l’hybridation multiplex in situ (ISH) des ganglions jugulaires-noduoses de souris, avec un accent particulier sur la détection de l’expression des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les ganglions jugulaires-noduoses fixés au formol ont été traités avec la technologie RNAscope pour détecter simultanément l’expression de deux RCPG représentatifs (récepteurs de la cholécystokinine et de la ghréline) en combinaison avec un gène marqueur de nodose (homéobox appariée 2b, Phox2b) ou de neurones afférents jugulaires (protéine de doigt de zinc du domaine PR 12, Prdm12). Les ganglions marqués ont été imagés à l’aide de la microscopie confocale pour déterminer la distribution et les modèles d’expression des transcriptions susmentionnées. En bref, les neurones afférents de Phox2b ont été trouvés pour exprimer abondamment le récepteur de la cholécystokinine (Cck1r) mais pas le récepteur de la ghréline (Ghsr). Un petit sous-ensemble de neurones afférents Prdm12 a également été trouvé pour exprimer Ghsr et / ou Cck1r. Les mises en garde techniques potentielles dans la conception, le traitement et l’interprétation du multiplex ISH sont discutées. L’approche décrite dans cet article peut aider les scientifiques à générer des cartes précises des profils transcriptionnels des neurones afférents vagaux.
Introduction
Les corps cellulaires des afférences vagales sont contenus dans les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses1,2,3. Leurs axones voyagent ensemble via plusieurs branches du nerf vague vers les territoires craniocervicaux, thoraciques et abdominaux4,5,6,7. À partir de leurs terminaisons viscérales, les afférences vagales peuvent répondre à un large éventail de stimuli physiologiques et nocifs8,9,10. Cependant, la distribution des molécules de signalisation et des récepteurs impliqués dans la détection vagale reste mal caractérisée. C’est en partie parce que les ganglions vagales, malgré leur petite taille, expriment un large spectre de récepteurs, y compris un grand nombre de RCPG8,11,12,13. De plus, les neurones afférents vagals sont intrinsèquement hétérogènes et présentent des profils moléculaires distincts14. Pour compliquer la question, les ganglions jugulaires, pétrosaux et nodoses sont attachés dans la souris, formant ainsi une seule masse ganglionnaire. Enfin, chez un sous-ensemble d’animaux, le ganglion nodosé est attaché au ganglion cervical supérieur sympathique15.
Dans le passé, les chercheurs se sont tournés vers l’immunohistochimie pour étudier la composition neurochimique des neurones afférentsvagals 16,17,18. Bien que l’immunohistochimie utilisant des anticorps validés soit utile, les résultats des études immunohistochimiques doivent être interprétés avec prudence. Par exemple, de nombreux efforts pour identifier des anticorps spécifiques contre les RCPG ont échoué19,20,21,22,23,24,25, ce qui a conduit les chercheurs à conclure que la majorité des anticorps contre les RCPG ne sont pas fiables. Pour contourner ces problèmes, la PCR quantitative (qPCR) a été largement utilisée pour évaluer l’expression des gènes dans la masse ganglionnaire vagale du rongeur26,27,28,29. Cependant, l’examen de l’expression des gènes à l’aide de la qPCR se fait au prix d’une perte d’information spatiale. En particulier, il est impossible de prédire combien de cellules ou quel(s) type(s) cellulaire(s) expriment un gène particulier d’intérêt (p. ex., nodose vs cellules jugulaires). Les problèmes récurrents comprennent également la contamination par les tissus adjacents et l’inclusion de longueurs variables du nerf vague, des ganglions cervicaux supérieurs et jugulaires pendant la dissection15. En raison des difficultés ci-dessus, la controverse entoure l’expression et la distribution de plusieurs RCPG dans les neurones afférents vagals. Un exemple particulièrement déroutant concerne le récepteur de la ghréline (Ghsr). Alors que certaines études ont trouvé une expression répandue de ce récepteur dans les neurones afférents vagaux30,31,32, d’autres ont trouvé que l’ARNm Ghsr était presque indétectable dans le ganglion nodosé11,14. Une cartographie détaillée de l’ARNm Ghsr dans la masse ganglionnaire vagale est donc justifiée.
L’hybridation in situ (ISH) a également été utilisée pour évaluer les modèles d’expression génique dans la masse ganglionnaire vagale7,11,12,33,34,35. Parce que les techniques à base d’ARN restent plus fiables et spécifiques que les techniques à base d’anticorps dans la plupart des circonstances36,37, les études ISH se sont avérées précieuses pour une meilleure compréhension du codage neurochimique des neurones afférents vagal. Néanmoins, les techniques ISH traditionnelles elles-mêmes ne sont pas sans réserves. L’ISH radioactif est sensible mais génère un fond et reste encombrant38. L’ISH non radioactif est moins compliqué mais aussi moins sensible38. En revanche, la méthode RNAscope ISH récemment développée est très sensible et génère un arrière-plan minimal39. La présente étude a appliqué un ARN fluorescent multiplex à la détection de RCPG dans les neurones afférents vagaux de la souris. Nous nous sommes concentrés sur la cartographie de la distribution de Ghsr et avons comparé sa distribution à celle du récepteur de la cholécystokinine (Cck1r), un autre RCPG bien connu pour être exprimé dans le ganglion nodostique34. Enfin, les deux facteurs de transcription, l’homéobox 2b de type apparié (Phox2b) et la protéine de doigt de zinc du domaine PR 12 (Prdm12), ont été utilisés comme marqueurs sélectifs pour les neurones nodose et afférent jugulaire, respectivement14. Sans visualiser Phox2b ou Prdm12, il serait difficile d’identifier avec certitude les afférences jugulaires par rapport aux nodoses. Les pièges techniques potentiels sont également discutés tout au long de l’article.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique de l’ISH a été inventée à la fin des années 196042. Cependant, ce n’est qu’au milieu des années 1980 qu’il a été appliqué pour la détection des ARNm dans les systèmes nerveux central et périphérique43,44. Compte tenu de l’hétérogénéité du système nerveux et des problèmes récurrents avec les anticorps, la localisation d’un transcrit particulier au niveau cellulaire reste un outil inestimable. N?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financé par la subvention des NIH #5P01DK119130-02. Les auteurs tiennent à remercier l’UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (dirigé par le Dr Phelps) et son personnel (Abhijit Bugde et Marcel Mettlen), soutenus en partie par la subvention des NIH #1S10OD021684-01, une ressource partagée du Harold C. Simmons Cancer Center, soutenue en partie par une subvention de soutien du NCI Cancer Center, P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
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