Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ
Summary
Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
Abstract
Este estudio describe un protocolo para la hibridación multiplex in situ (ISH) de los ganglios yugulares-nodosis de ratón, con un énfasis particular en la detección de la expresión de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Los ganglios de yugular-nodosa fijados con formalina se procesaron con la tecnología RNAscope para detectar simultáneamente la expresión de dos GPCR representativos (receptores de colecistoquinina y grelina) en combinación con un gen marcador de nodosa (homeobox 2b, Phox2b) o neuronas aferentes yugulares (proteína de dedo de zinc de dominio PR 12, Prdm12). Los ganglios marcados fueron fotografiados utilizando microscopía confocal para determinar la distribución y los patrones de expresión de las transcripciones antes mencionadas. Brevemente, se encontró que las neuronas aferentes Phox2b expresan abundantemente el receptor de colecistoquinina (Cck1r) pero no el receptor de grelina (Ghsr). También se encontró que un pequeño subconjunto de neuronas aferentes Prdm12 expresan Ghsr y / o Cck1r. Se discuten posibles advertencias técnicas en el diseño, procesamiento e interpretación de multiplex ISH. El enfoque descrito en este artículo puede ayudar a los científicos a generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.
Introduction
Los cuerpos celulares de los aferentes vagales están contenidos en los ganglios yugular, petrosal y nodosis1,2,3. Sus axones viajan juntos a través de varias ramas del nervio vago a los territorios craneocervicical, torácico y abdominal4,5,6,7. Desde sus terminaciones viscerales, las aferencias vagales pueden responder a una amplia gama de estímulos fisiológicos y nocivos8,9,10. Sin embargo, la distribución de las moléculas de señalización y los receptores involucrados en la detección vagagal sigue estando mal caracterizada. Esto se debe en parte a que los ganglios vagales, a pesar de su pequeño tamaño, expresan un amplio espectro de receptores, incluyendo un gran número de GPCR8,11,12,13. Además, las neuronas aferentes vagales son inherentemente heterogéneas y muestran perfiles moleculares distintos14. Para complicar el asunto, los ganglios yugular, petrosal y nodoso se unen en el ratón, formando así una sola masa ganglionar. Por último, en un subconjunto de animales, el ganglio de la nodosa está unido al ganglio cervical superior simpático15.
En el pasado, los investigadores han recurrido a la inmunohistoquímica para estudiar la composición neuroquímica de las neuronas aferentes vagales16,17,18. Si bien la inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos validados es útil, los resultados de los estudios inmunohistoquímicos deben interpretarse con precaución. Por ejemplo, numerosos esfuerzos para identificar anticuerpos específicos contra los GPCR han fallado19,20,21,22,23,24,25,lo que lleva a los investigadores a concluir que la mayoría de los anticuerpos contra los GPCR no son confiables. Para eludir estos problemas, la PCR cuantitativa (qPCR) se ha utilizado ampliamente para evaluar la expresión génica en la masa ganglionar vagal de roedores26,27,28,29. Sin embargo, el examen de la expresión génica utilizando qPCR ocurre a costa de una pérdida de información espacial. En particular, no se puede predecir cuántas células o qué tipo de célula expresan un gen particular de interés (por ejemplo, nodosa vs. células yugulares). Los problemas recurrentes también incluyen la contaminación con tejidos adyacentes y la inclusión de longitudes variables del nervio vago, los ganglios cervicales superiores y yugulares durante la disección15. Como resultado de las dificultades anteriores, la controversia rodea la expresión y distribución de varios GPCR en neuronas aferentes vagales. Un ejemplo particularmente desconcertante se relaciona con el receptor de grelina (Ghsr). Mientras que algunos estudios han encontrado una expresión generalizada de este receptor en las neuronas aferentes vagales30,31,32,otros han encontrado que el ARNm de Ghsr es casi indetectable en el ganglio de la nodosis11,14. Por lo tanto, se justifica un mapeo detallado del ARNm de Ghsr en la masa ganglionar vagal.
La hibridación in situ (ISH) también se ha utilizado para evaluar patrones de expresión génica en la masa ganglionar vagal7,11,12,33,34,35. Debido a que las técnicas basadas en ARN siguen siendo más confiables y específicas que las técnicas basadas en anticuerpos en la mayoría de las circunstancias36,37, los estudios de ISH han demostrado ser valiosos para una mejor comprensión de la codificación neuroquímica de las neuronas aferentes vagales. Sin embargo, las técnicas tradicionales de ISH en sí mismas no están exentas de advertencias. La ISH radiactiva es sensible pero genera fondo y sigue siendo engorrosa38. La ISH no radiactiva es menos complicada pero también menos sensible38. En contraste, el método RNAscope ISH recientemente desarrollado es altamente sensible y genera un fondo mínimo39. El estudio actual aplicó RNAscope fluorescente multiplex a la detección de GPCR en neuronas aferentes vagales del ratón. Nos centramos en mapear la distribución de Ghsr y comparamos su distribución con la del receptor de colecistoquinina (Cck1r), otro GPCR bien conocido por expresarse en el ganglio de la nodosis34. Por último, los dos factores de transcripción, homeobox 2b (Phox2b) y proteína 12 del dedo de zinc del dominio PR (Prdm12), se utilizaron como marcadores selectivos para las neuronas aferentes de nodosa y yugular, respectivamente14. Sin visualizar Phox2b o Prdm12, sería difícil identificar las aferencias yugulares frente a las nodosas con certeza. Las posibles trampas técnicas también se discuten a lo largo del artículo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de ISH fue inventada a finales de la década de 196042. Sin embargo, no es hasta mediados de la década de 1980 que se aplicó para la detección de ARNm en los sistemas nerviosos central y periférico43,44. Teniendo en cuenta la heterogeneidad del sistema nervioso y los problemas recurrentes con los anticuerpos, la localización de una transcripción particular a nivel celular sigue siendo una herramienta invaluable. No obstan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Neuroanatomy/Histology/Brain Injection Core financiado por la subvención de los NIH #5P01DK119130-02. Los autores desean agradecer la asistencia del UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (encabezado por el Dr. Phelps) y su personal (Abhijit Bugde y Marcel Mettlen), apoyado en parte por la Subvención nih #1S10OD021684-01, un recurso compartido del Centro Oncológico Harold C. Simmons, apoyado en parte por una subvención de apoyo del Centro Oncológico del NCI, P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
