Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie
Summary
Multiplex in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om tegelijkertijd de transcripten voor twee G-eiwit-gekoppelde receptoren en één transcriptiefactor in het gehele vagale ganglionaire complex van de volwassen muis te visualiseren. Dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen te genereren.
Abstract
Deze studie beschrijft een protocol voor de multiplex in situ hybridisatie (ISH) van de muis jugulair-nodose ganglia, met een bijzondere nadruk op het detecteren van de expressie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR’s). Formaline-gefixeerde jugulaire-nodose ganglia werden verwerkt met de RNAscope-technologie om tegelijkertijd de expressie van twee representatieve GPCR’s (cholecystokinine en ghrelinereceptoren) te detecteren in combinatie met één markergen van nodose (gepaarde homeobox 2b, Phox2b) of jugulaire afferente neuronen (PR-domein zinkvingereiwit 12, Prdm12). Gelabelde ganglia werden afgebeeld met behulp van confocale microscopie om de distributie- en expressiepatronen van de bovengenoemde transcripten te bepalen. Kortom, Phox2b afferente neuronen bleken overvloedig de cholecystokininereceptor (Cck1r) tot expressie te brengen, maar niet de ghrelinereceptor (Ghsr). Een kleine subset van Prdm12 afferente neuronen bleek ook Ghsr en/of Cck1r tot expressie te brengen. Mogelijke technische kanttekeningen bij het ontwerp, de verwerking en de interpretatie van multiplex ISH worden besproken. De aanpak die in dit artikel wordt beschreven, kan wetenschappers helpen bij het genereren van nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen.
Introduction
De cellichamen van vagale afferente stoffen bevinden zich in de jugulaire, petrosale en nodose ganglia1,2,3. Hun axonen reizen samen via verschillende takken van de nervus vagus naar craniocervicale, thoracale en abdominale territoria4,5,6,7. Vanuit hun viscerale uiteinden kunnen vagale afferente stoffen reageren op een breed scala aan fysiologische en schadelijke stimuli8,9,10. De verdeling van signaalmoleculen en receptoren die betrokken zijn bij vagale detectie blijft echter slecht gekarakteriseerd. Dit komt deels omdat de vagale ganglia, ondanks hun kleine omvang, een breed spectrum van receptoren uitdrukken, waaronder een groot aantal GPCR’s8,11,12,13. Bovendien zijn vagale afferente neuronen inherent heterogeen en vertonen ze verschillende moleculaire profielen14. Om de zaak te compliceren, worden de jugulaire, petrosale en nodose ganglia in de muis bevestigd, waardoor een enkele ganglionische massa wordt gevormd. Ten slotte is in een subset van dieren het nodose ganglion bevestigd aan het sympathische superieure cervicale ganglion15.
In het verleden hebben onderzoekers zich tot immunohistochemie gewend om de neurochemische samenstelling van vagale afferente neuronen te bestuderen16,17,18. Hoewel immunohistochemie met behulp van gevalideerde antilichamen nuttig is, moeten de resultaten van immunohistochemische studies met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Talrijke pogingen om specifieke antilichamen tegen GPCR’s te identificeren, zijn bijvoorbeeld mislukt19,20,21,22,23,24,25, waardoor onderzoekers concluderen dat de meerderheid van de antilichamen tegen GPCR’s onbetrouwbaar zijn. Om deze problemen te omzeilen, is kwantitatieve PCR (qPCR) op grote schaal gebruikt voor het beoordelen van genexpressie in de vagale ganglionaire massa van knaagdieren26,27,28,29. Het onderzoeken van genexpressie met behulp van qPCR gaat echter ten koste van een verlies van ruimtelijke informatie. In het bijzonder kan niet worden voorspeld hoeveel cellen of welk celtype (s) een bepaald gen van belang uitdrukken (bijv. Nodose vs. jugulaire cellen). Terugkerende problemen omvatten ook de besmetting met aangrenzende weefsels en de opname van variabele lengtes van de nervus vagus, superieure cervicale en jugulaire ganglia tijdens dissectie15. Als gevolg van de bovenstaande moeilijkheden is er controverse rond de expressie en distributie van verschillende GPCR’s in vagale afferente neuronen. Een bijzonder raadselachtig voorbeeld heeft betrekking op de ghrelinereceptor (Ghsr). Terwijl sommige studies wijdverspreide expressie van deze receptor hebben gevonden in vagale afferente neuronen30,31,32,hebben anderen vastgesteld dat Ghsr-mRNA bijna niet detecteerbaar is in het nodose ganglion11,14. Gedetailleerde mapping van Ghsr-mRNA in de vagale ganglionaire massa is daarom gerechtvaardigd.
In situ hybridisatie (ISH) is ook gebruikt om genexpressiepatronen in de vagale ganglionaire massa7,11,12,33,34,35te beoordelen. Omdat op RNA gebaseerde technieken onder de meeste omstandigheden betrouwbaarder en specifieker blijven dan op antilichamen gebaseerde technieken36,37, zijn ISH-studies waardevol gebleken voor een beter begrip van de neurochemische codering van vagale afferente neuronen. Toch zijn traditionele ISH-technieken zelf niet zonder kanttekeningen. Radioactieve ISH is gevoelig maar genereert achtergrond en blijft omslachtig38. Niet-radioactieve ISH is minder ingewikkeld maar ook minder gevoelig38. De recent ontwikkelde RNAscope ISH-methode is daarentegen zeer gevoelig en genereert minimale achtergrond39. De huidige studie paste multiplex fluorescerende RNAscope toe op de detectie van GPCR’s in vagale afferente neuronen van de muis. We concentreerden ons op het in kaart brengen van de distributie van Ghsr en vergeleken de distributie met die van de cholecystokininereceptor (Cck1r), een andere GPCR waarvan bekend is dat deze tot expressie komt in het nodose ganglion34. Ten slotte werden de twee transcriptiefactoren, gepaard-achtige homeobox 2b (Phox2b) en PR-domein zinkvingereiwit 12 (Prdm12), gebruikt als selectieve markers voor nodose en jugulaire afferente neuronen, respectievelijk14. Zonder Phox2b of Prdm12 te visualiseren, zou het een uitdaging zijn om jugulaire versus nodose afferente stoffen met zekerheid te identificeren. Mogelijke technische valkuilen worden ook in het hele artikel besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De techniek van ISH werd uitgevonden in de late jaren 196042. Het is echter pas in het midden van de jaren 1980 dat het werd toegepast voor de detectie van mRNA’s in het centrale en perifere zenuwstelsel43,44. Gezien de heterogeniteit van het zenuwstelsel en terugkerende problemen met antilichamen, blijft het lokaliseren van een bepaald transcript op cellulair niveau een waardevol hulpmiddel. Niettemin zijn traditionele ISH-methoden bewerk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core gefinancierd door NIH-subsidie #5P01DK119130-02. De auteurs willen graag de hulp erkennen van de UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (onder leiding van Dr. Phelps) en zijn personeel (Abhijit Bugde en Marcel Mettlen), gedeeltelijk ondersteund door de NIH Grant #1S10OD021684-01, een gedeelde bron van het Harold C. Simmons Cancer Center, gedeeltelijk ondersteund door een NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C freezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | photo and design software | |
| Baking oven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Cover glass | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | mounting medium |
| HybEZ oven | hybridization oven | ||
| Hydrophobic pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Large scissors | Henry Schein | 100-7561 | |
| Micro centrifuge tubes | VWR | 20170-333 | |
| Minipump variable flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescent biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescent biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | mounting medium for fluorescently labeled cells | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplex kit |
| RNAscope probe Mouse Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope probe Mouse DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope probe Mouse Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope probe Mouse Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope probe Mouse Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase decontaminating solution |
| Small dissecting scissors | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| User manual | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
References
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
- Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344 (2020).
- Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
- Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
- Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
- Page, A. J., O’Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
- Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
- Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985 (2017).
- Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
- Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
- Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
- Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
- Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
- Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
- Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
- Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
- Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
- Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
- Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
- Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
- Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
- Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
- Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
- Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986 (2020).
- Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415 (2020).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
- Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
- Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
- Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), 1136-1141 (1994).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
- Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
- Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
- McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
- Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
- Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
- D’Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
- Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
- Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
- Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022 (2020).
- Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035 (2020).
