Обнаружение экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в афферентных нейронах вагусного нерва мыши с использованием мультиплексной гибридизации In Situ

Клеточные тела вагусных афферентов содержатся в яремных, петрозальных и узловых^{ганглиях 1,2,3.} Их аксоны путешествуют вместе через несколько ветвей блуждающего нерва в краниоцервикальную, грудную и брюшную зоны^4,5,6,7. Из своих висцеральных окончаний вагусные афференты могут реагировать на широкий спектр физиологических и вредных раздражителей^8,9,10. Однако распределение сигнальных молекул и рецепторов, участвующих в вагусном зондировании, остается плохо охарактеризованным. Отчасти это связано с тем, что вагусные ганглии, несмотря на свои небольшие размеры, экспрессируют широкий спектр рецепторов, включая большое количество GPCR^8,11,12,13. Кроме того, вагусные афферентные нейроны по своей природе неоднородны и имеют различные молекулярные профили^14. Чтобы усложнить дело, яремные, петрозальные и узловые ганглии прикрепляются к мыши, образуя тем самым единую ганглионную массу. Наконец, у подмножества животных узелковый ганглий прикреплен к симпатическому верхнему шейному ганглию^15.

В прошлом исследователи обращались к иммуногистохимии для изучения нейрохимического состава вагусных афферентных нейронов^16,17,18. Хотя иммуногистохимия с использованием валидированных антител полезна, результаты иммуногистохимических исследований следует интерпретировать с осторожностью. Например, многочисленные усилия по выявлению специфических антител против GPCR потерпели неудачу^{19,20,21,22,23,24,25,}что привело исследователей к выводу, что большинство антител против GPCR ненадежны. Чтобы обойти эти проблемы, количественная ПЦР (qPCR) широко используется для оценки экспрессии генов у ганглионной массы блуждающего блуждающего нерва^26,27,28,29. Однако изучение экспрессии генов с помощью qPCR происходит за счет потери пространственной информации. В частности, невозможно предсказать, сколько клеток или какой тип (типы) клеток экспрессируют конкретный ген, представляющий интерес (например, узелковые или яремные клетки). Повторяющиеся проблемы также включают загрязнение соседними тканями и включение переменной длины блуждающего нерва, верхнего шейного отдела и яремных ганглиев во время рассечения^15. В результате вышеуказанных трудностей споры окружают экспрессию и распределение нескольких GPCR в вагусных афферентных нейронах. Один особенно загадочный пример относится к рецептору грелина (Ghsr). В то время как некоторые исследования обнаружили широкую экспрессию этого рецептора в вагусных афферентных нейронах^30,31,32,другие обнаружили, что мРНК Ghsr почти не обнаруживается в узловом ганглиях^11,14. Поэтому детальное картирование мРНК Ghsr в ганглионной массе блуждающего нерва оправдано.

Гибридизация in situ (ISH) также использовалась для оценки паттернов экспрессии генов в вагусной ганглионной массе^{7,11,12,33,34,35.} Поскольку методы на основе РНК остаются более надежными и специфичными, чем методы на основе антител в большинстве случаев^36,37,исследования ISH оказались ценными для лучшего понимания нейрохимического кодирования вагусных афферентных нейронов. Тем не менее, традиционные техники ISH сами по себе не лишены предостережений. Радиоактивный ISH чувствителен, но генерирует фон и остается громоздким^38. Нерадиоактивный ISH менее сложен, но и^{менее чувствителен 38.} Напротив, недавно разработанный метод RNAscope ISH является высокочувствительным и генерирует минимальный фон^39. В текущем исследовании применялся мультиплексный флуоресцентный РНКАскоп для обнаружения GPCR в вагусных афферентных нейронах мыши. Мы сосредоточились на картировании распределения Ghsr и сравнили его распределение с распределением рецептора холецистокинина (Cck1r), другого GPCR, который, как известно, экспрессируется в узловом ганглии^34. Наконец, два фактора транскрипции, пароподобный гомеобокс 2b (Phox2b) и PR-домен цинкового белка пальца 12 (Prdm12), были использованы в качестве селективных маркеров для узловых и яремных афферентных нейронов, соответственно^14. Без визуализации Phox2b или Prdm12 было бы сложно с уверенностью идентифицировать яремные и узловатые афференты. Потенциальные технические подводные камни также обсуждаются на протяжении всей статьи.