קביעת נשימה מיטוכונדריאלית וגליקוליזיס בדגימות רקמת רשתית Ex Vivo
Summary
מתואר כאן פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקת מתח מיטוכונדריאלית ובוחן קצב גליקוליטי בדגימות רקמת רשתית ex vivo באמצעות ביואנלייזר מסחרי.
Abstract
נשימה מיטוכונדריאלית היא מסלול קריטי לייצור אנרגיה בכל התאים, במיוחד קולטני אור ברשתית בעלי חילוף חומרים פעיל מאוד. בנוסף, קולטני אור מציגים גם גליקוליזה אירובית גבוהה כמו תאים סרטניים. מדידות מדויקות של פעילויות מטבוליות אלה יכולות לספק תובנות חשובות על הומאוסטזיס תאי בתנאים פיזיולוגיים ובמדינות מחלה. בדיקות מבוססות מיקרו-לוחית בעלות תפוקה גבוהה פותחו כדי למדוד נשימה מיטוכונדריאלית ופעילויות מטבוליות שונות בתאים חיים. עם זאת, רובם המכריע של אלה מפותחים עבור תאים מתורבתים ולא עברו אופטימיזציה עבור דגימות רקמה שלמה עבור יישום ex vivo. מתואר כאן פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב, באמצעות טכנולוגיית פלואורסצנטיות מבוססת מיקרופלסטיט, כדי למדוד ישירות את קצב צריכת החמצן (OCR) כאינדיקטור לנשימה מיטוכונדריאלית, כמו גם שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) כאינדיקטור לגליקוליזיס, ברקמת רשתית ex vivo שלמה. שיטה זו שימשה כדי להעריך בהצלחה פעילויות מטבוליות רשתית עכבר למבוגרים ולהדגים את היישום שלה בחקירת מנגנונים תאיים של הזדקנות ומחלות.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים המווסתים את חילוף החומרים התאי, איתות, הומאוסטזיס, אפופטוזיס על ידי תיאום תהליכים פיזיולוגיים חיוניים מרובים1. המיטוכונדריה משמשת תחנת הכוח בתא ליצירת אדנוסין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני (OXPHOS) ולספק אנרגיה התומכת כמעט בכל האירועים התאיים. רוב החמצן התאי מטבוליזם במיטוכונדריה, שם הוא משמש כקבל האלקטרונים הסופי בשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC) במהלך נשימה אירובית. כמויות נמוכות של ATP ניתן גם לייצר גליקוליזה בציטוסול, שבו גלוקוז מומר pyruvate, אשר ניתן להמיר עוד יותר לקטט או להיות מועבר לתוך מיטוכונדריה מחומצן אצטיל-CoA, מצע במחזור חומצה tricarboxylic (מחזור TCA).
הרשתית היא אחת הרקמות הפעילות ביותר מבחינה מטבולית ביונקים2, המציגה רמות גבוהות של נשימה מיטוכונדריאלית וצריכת חמצן גבוהה מאוד3. מוט ו photoreceptors חרוט מכילים צפיפות גבוהה של מיטוכונדריה4, ו OXPHOS מייצר את רוב ATP ברשית5. בנוסף, הרשתית מסתמכת גם בכבדות על גליקוליזה אירובית6,7 על ידי המרת גלוקוז לקטט5. פגמים מיטוכונדריאליים קשורים למחלות ניווניות שונות8,9; ועם דרישות האנרגיה הגבוהה הייחודיות שלה, הרשתית פגיעה במיוחד לפגמים מטבוליים, כולל אלה המשפיעים על OXPHOS4 מיטוכונדריאלי וגליקוליזיס10. תפקוד לקוי מיטוכונדריאלי ופגמים בגליקוליזיס מעורבים במחלות ניווניות ברשתית11,12 ו- macular13, ניוון מקולרי הקשור לגיל10,14,15,16, ורטינופתיה סוכרתית17,18. לכן, מדידות מדויקות של נשימה מיטוכונדריאלית וטליקוליזה יכולות לספק פרמטרים חשובים להערכת שלמות ובריאות הרשתית.
ניתן למדוד נשימה מיטוכונדריאלית באמצעות קביעת שיעור צריכת החמצן (OCR). בהתחשב בכך ההמרה של גלוקוז pyruvate ולאחר מכן לקטט תוצאות שחול של פרוטונים לתוך חמצה של הסביבה החוץ תאית, מדידות של שיעור החמצה חוץ תאית (ECAR) לספק אינדיקציה של שטף גליקוליזה. כמו הרשתית מורכבת מסוגי תאים מרובים עם יחסים אינטימיים וסינרגיה פעילה, כולל חילופי מצעים6, זה הכרחי לנתח את התפקוד המיטוכונדריאלי ואת חילוף החומרים בהקשר של רקמת הרשתית כולה עם למינציה ומעגלים שלמים. במשך העשורים האחרונים, אלקטרודות O2 מסוג קלארק ומיקרו-ectectrodes חמצן אחרים שימשו למדידת צריכת חמצן ברשתית19,20,21. אלקטרודות חמצן אלה יש מגבלות עיקריות ברגישות, דרישה של נפח מדגם גדול, ואת הצורך ערבוב מתמשך של דגימת השעיה, אשר בדרך כלל מוביל להפרעה של הקשר הסלולר והרקמות. הפרוטוקול המתואר כאן פותח באמצעות טכניקה מבוססת מיקרו-פלאט, פלואורסצנטיות למדידת חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית ברקמת רשתית עכבר ex vivo ניתחה זה עתה. זה מאפשר מדידות בזמן אמת באמצע תפוקה של OCR ו- ECAR בו זמנית באמצעות מדגם קטן (פונץ ‘1 מ”מ) של רקמת רשתית ex vivo תוך הימנעות הצורך השעיה ערבוב מתמשך.
הוכח כאן הוא ההליך הניסיוני לבדיקת מתח מיטוכונדריאלי ובוחן קצב גליקוליטי על דיסקי ניקוב רשתית שזה עתה נותחו. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של פעילויות מטבוליות הקשורות במיטוכונדריה בהקשר של רקמת ex vivo. בשונה מבוחות שבוצעו באמצעות תאים מתורבתים, הקריאות המתקבלות כאן משקפות את חילוף החומרים של האנרגיה המשולבת ברמת הרקמה ומושפעות מאינטראקציות בין סוגי התאים השונים בתוך הרקמה. הפרוטוקול משתנה מגרסה שפורסמה בעבר22,23 כדי להסתגל לדור החדש של מנתח השטף החוץ-תאי Agilent Seahorse 24-בארות (XFe24) עם צלחת לכידת אי. בינוני אסאי, ריכוזי תרכובת הזרקה, ומספר/משך של מחזורי בדיקת אופטימיזציה גם עבור רקמת הרשתית. פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב ניתן להכנת דיסקים ניקוב רשתית. מידע נוסף על הגדרת התוכנית וניתוח נתונים ניתן לקבל ממדריך המשתמש של היצרן24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מפורטות הוראות לביצוע בדיקות מבוססות מיקרו-פלט של נשימה מיטוכונדריאלית ופעילות גליקוליזה באמצעות דיסקים של ניקוב רשתית ex vivo, שניתחו זה עתה. הפרוטוקול עבר אופטימיזציה ל: 1) להבטיח שימוש במדיום בדיקת אסאי מתאים לרקמת רשתית ex vivo ; 2) להעסיק בגודל הנכון של דיסקים ניקוב רשתית כדי לק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר התוך-ארצית של מכון העיניים הלאומי (ZIAEY000450 ו- ZIAEY000546).
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
- Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
- Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
- Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
- Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
- Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
- Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
- Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
- Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
- Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
- Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
- Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
- Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
- Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
- Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
- Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
- Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
- . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
- . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
- . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
- . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
- Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
