Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l’omeostasi e l’apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici ^cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell’ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell’acido tricarbossilico (ciclo TCA).

La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei ^mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente ^elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un’alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell’ATP nella ^retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi ^aerobica6,7 convertendo il glucosio in ^lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della ^retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all’età10,14,15,16 e nella retinopatia ^{diabetica17,18}. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l’integrità e la salute della retina.

La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l’estrusione di protoni e l’acidificazione dell’ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un’indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di ^substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell’intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi _O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un’agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.

Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all’interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente ^{pubblicata22,23} per adattarsi alla nuova generazione dell’analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull’analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l’utente del ^{produttore24,25,26}.