Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

ミトコンドリアは、細胞代謝、シグナル伝達、ホメオスタシス、アポトーシスを複数の重要な生理学的プロセスを調整することによって調節する必須のオルガネラ^である1。ミトコンドリアは、酸化リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成し、ほぼすべての細胞イベントをサポートするエネルギーを提供する細胞内の大国として機能します。細胞酸素の大部分はミトコンドリアで代謝され、好気呼吸中の電子輸送鎖(ETC)の最終的な電子アクセクサとして機能する。低量のATPは、グルコースをピルビン酸に変換するサイトゾルの解糖からも製造することができ、さらに乳酸に変換したり、ミトコンドリアに輸送したり、三カルボン酸サイクル(TCAサイクル)の基質であるアセチルCoAに酸化することができます。

このレティナは哺乳動物2において最も代謝活性の高い組織の1^つで、高レベルのミトコンドリア呼吸と非常に高い酸素消費量を示す³。ロッドおよびコーン光受容体は、ミトコンドリア⁴の高密度を含み、OXPHOSは、retina5で最もATPを生成します。さらに、このレチナは、グルコースを^乳酸5に変換することにより、好気性解糖^6,7にも大きく依存しています。ミトコンドリア欠損症は、様々な神経変性疾患に関連しています^8,9;そして、その独特の高エネルギー需要と, retinaは、特に代謝欠陥に対して脆弱です, ミトコンドリア^OXPHOS4および解糖症¹⁰に影響を与えるものを含む.ミトコンドリア機能障害と解糖の欠損は、網膜^11,12及び黄斑¹³変性疾患、加齢黄斑変性^{症10、14、15、16}、および糖尿病網膜症^17,18に関与している。したがって、ミトコンドリア呼吸および解糖の正確な測定は、レティナの完全性および健康を評価するための重要なパラメータを提供することができる。

ミトコンドリア呼吸は酸素消費率(OCR)の測定によって測定することができる。グルコースからピルビン酸への変換、そしてその後の乳酸塩への変換は、細胞外環境への陽子の押出および酸性化をもたらすことを考えると、細胞外酸性化率(ECAR)の測定は、グリコリシスフラックスの指標を提供する。このレティナは、基質の交換を含む、親密な関係と活発な相乗効果を持つ複数の細胞タイプで構成^{されるため、無傷}のラミネーションと回路を持つ全レチン組織のコンテキストでミトコンドリアの機能と代謝を分析することが不可欠です。過去数十年にわたり、クラーク型_O2電極および他の酸素マイクロ電極は、retina19,20,21における酸素消費量を測定するために使用されてきました。これらの酸素電極は、感度、大きなサンプル体積の要件、および通常、細胞および組織の文脈の破壊につながる懸濁試料の連続攪拌の必要性に大きな制限を有する。ここで説明するプロトコルは、ミトコンドリアのエネルギー代謝を解剖したばかりのex vivoマウスの残膜組織におけるミトコンドリアのエネルギー代謝を測定するマイクロプレートベースの蛍光技術を用いて開発された。それは懸濁および連続的なかき混ぜのための必要性を避けながら、ex vivoのレチナル組織の小さいサンプル(1mmのパンチ)を同時に使用してOCRとECARの両方の中間の実時間測定を可能にする。

ここで示されているのが、解剖したばかりのレチナルパンチディスク上のミトコンドリア応力アッセイおよび解糖率アッセイの実験手順です。このプロトコルは、ミトコンドリア関連代謝活動を、エキビボ組織のコンテキストで測定することを可能にする。培養細胞を用いて行うアッセイとは異なり、ここで得られた測定値は組織レベルでの結合されたエネルギー代謝を反映し、組織内の異なる細胞タイプ間の相互作用の影響を受ける。このプロトコルは、アイレットキャプチャプレートを備えたアジレントシーホース細胞外フラックス24ウェル(XFe24)アナライザの新世代に適応するために、以前に公開されたバージョン^22,23から変更されます。アッセイ培地、注入化合物濃度、およびアッセイサイクルの数/持続時間も、レチン組織に対して最適化されています。レチナルパンチディスクの準備のために詳細なステップバイステッププロトコルが与えられています。プログラムのセットアップとデータ分析の詳細については、製造元のユーザーガイド^24,25,26から入手できます。