Détermination de la respiration mitochondriale et de la glycolyse dans des échantillons de tissu rétinien ex vivo

Les mitochondries sont des organites essentiels qui régulent le métabolisme cellulaire, la signalisation, l’homéostasie et l’apoptose en coordonnant plusieurs processus physiologiques ^cruciaux1. Les mitochondries servent de centrale électrique dans la cellule pour générer de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative (OXPHOS) et fournir de l’énergie qui soutient presque tous les événements cellulaires. La majorité de l’oxygène cellulaire est métabolisée dans les mitochondries, où il sert d’accepteur final d’électrons dans la chaîne de transport d’électrons (ETC) pendant la respiration aérobie. De faibles quantités d’ATP peuvent également être produites à partir de la glycolyse dans le cytosol, où le glucose est converti en pyruvate, qui peut être converti en lactate ou être transporté dans les mitochondries et oxydé en acétyl-CoA, un substrat du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle TCA).

La rétine est l’un des tissus les plus métaboliquement actifs chez les ^mammifères2, présentant des niveaux élevés de respiration mitochondriale et une consommation d’oxygène extrêmement ^élevée3. Les photorécepteurs des bâtonnets et des cônes contiennent une densité élevée de mitochondries4, et OXPHOS génère la plupart de l’ATP dans la ^rétine5. De plus, la rétine repose aussi fortement sur la glycolyse ^aérobie6,7 en convertissant le glucose en ^lactate5. Les défauts mitochondriaux sont associés à diverses maladies neurodégénératives8,9; et avec ses demandes énergétiques élevées uniques, la rétine est particulièrement vulnérable aux défauts métaboliques, y compris ceux affectant ^OXPHOS4 mitochondrial et la glycolyse10. Le dysfonctionnement mitochondrial et les défauts de glycolyse sont impliqués dans les maladies dégénératives rétiniennes11,12 et ^maculaires13, la dégénérescence maculaire liée à l’âge10,14,15,16 et la rétinopathie ^{diabétique17,18}. Par conséquent, des mesures précises de la respiration mitochondriale et de la glycolyse peuvent fournir des paramètres importants pour évaluer l’intégrité et la santé de la rétine.

La respiration mitochondriale peut être mesurée par la détermination du taux de consommation d’oxygène (OCR). Étant donné que la conversion du glucose en pyruvate et par la suite en lactate entraîne l’extrusion de protons et l’acidification de l’environnement extracellulaire, les mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) fournissent une indication du flux de glycolyse. Comme la rétine est composée de plusieurs types de cellules avec des relations intimes et une synergie active, y compris l’échange de ^substrats6, il est impératif d’analyser la fonction mitochondriale et le métabolisme dans le contexte de tissu rétinien entier avec une lamination et des circuits intacts. Au cours des dernières décennies, les électrodes _O2 de type Clark et d’autres microélectrodes d’oxygène ont été utilisées pour mesurer la consommation d’oxygène dans la rétine19,20,21. Ces électrodes d’oxygène ont des limites majeures en termes de sensibilité, l’exigence d’un grand volume d’échantillon et la nécessité d’une agitation continue de l’échantillon en suspension, ce qui entraîne généralement la perturbation du contexte cellulaire et tissulaire. Le protocole décrit ici a été développé à l’aide d’une technique de fluorescence à base de microplaques pour mesurer le métabolisme énergétique mitochondrial dans le tissu rétinien ex vivo de souris fraîchement disséqué. Il permet des mesures en temps réel à mi-débit de l’OCR et de l’ECAR simultanément à l’aide d’un petit échantillon (poinçon de 1 mm) de tissu rétinien ex vivo tout en évitant le besoin de suspension et d’agitation continue.

Démontrée ici est la procédure expérimentale pour le test de stress mitochondrial et le test de taux glycolytique sur des disques de perforation rétiniens fraîchement disséqués. Ce protocole permet de mesurer les activités métaboliques liées aux mitochondries dans un contexte tissulaire ex vivo. Contrairement aux essais effectués à l’aide de cellules cultivées, les lectures obtenues ici reflètent le métabolisme énergétique combiné au niveau tissulaire et sont influencées par les interactions entre les différents types de cellules dans le tissu. Le protocole est modifié par rapport à une version précédemment ^{publiée22,23} pour s’adapter à la nouvelle génération de l’analyseur de flux extracellulaire Agilent Seahorse 24-wells (XFe24) avec plaque Islet Capture. Le milieu d’essai, les concentrations de composés d’injection et le nombre/la durée des cycles d’essai ont également été optimisés pour le tissu rétinien. Un protocole détaillé étape par étape est donné pour la préparation des disques de poinçonnage rétiniens. Plus d’informations sur la configuration du programme et l’analyse des données peuvent être obtenues à partir du guide de l’utilisateur du fabricant24,25,26.