Determinación de la respiración mitocondrial y la glucólisis en muestras de tejido retiniano ex vivo
Summary
Aquí se describe un protocolo detallado para realizar el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de velocidad glucolítica en muestras de tejido retiniano ex vivo utilizando un bioanalizador comercial.
Abstract
La respiración mitocondrial es una vía crítica de generación de energía en todas las células, especialmente en los fotorreceptores de la retina que poseen un metabolismo altamente activo. Además, los fotorreceptores también exhiben una alta glucólisis aeróbica como las células cancerosas. Las mediciones precisas de estas actividades metabólicas pueden proporcionar información valiosa sobre la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y en estados de enfermedad. Se han desarrollado ensayos basados en microplacas de alto rendimiento para medir la respiración mitocondrial y diversas actividades metabólicas en células vivas. Sin embargo, una gran mayoría de estos están desarrollados para células cultivadas y no han sido optimizados para muestras de tejido intacto y para su aplicación ex vivo. Aquí se describe un protocolo detallado paso a paso, utilizando tecnología de fluorescencia basada en microplacas, para medir directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) como indicador de la respiración mitocondrial, así como la tasa de acidificación extracelular (ECAR) como indicador de glucólisis, en tejido retiniano ex vivo intacto. Este método se ha utilizado para evaluar con éxito las actividades metabólicas en la retina del ratón adulto y demostrar su aplicación en la investigación de los mecanismos celulares del envejecimiento y la enfermedad.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan el metabolismo celular, la señalización, la homeostasis y la apoptosis mediante la coordinación de múltiples procesos fisiológicos cruciales1. Las mitocondrias sirven como la fuente de energía en la célula para generar trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y proporcionar energía que soporta casi todos los eventos celulares. La mayoría del oxígeno celular se metaboliza en las mitocondrias, donde sirve como el aceptor final de electrones en la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la respiración aeróbica. También se pueden producir bajas cantidades de ATP a partir de la glucólisis en el citosol, donde la glucosa se convierte en piruvato, que puede convertirse en lactato o transportarse a las mitocondrias y oxidarse a acetil-CoA, un sustrato en el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo TCA).
La retina es uno de los tejidos metabólicamente más activos en mamíferos2, mostrando altos niveles de respiración mitocondrial y un consumo de oxígeno extremadamente alto3. Los fotorreceptores de bastón y cono contienen una alta densidad de mitocondrias4, y OXPHOS genera la mayor cantidad de ATP en la retina5. Además, la retina también depende en gran medida de la glucólisis aeróbica6,7 al convertir la glucosa en lactato5. Los defectos mitocondriales se asocian a diversas enfermedades neurodegenerativas8,9; y con sus altas demandas energéticas únicas, la retina es especialmente vulnerable a los defectos metabólicos, incluidos los que afectan a OXPHOS4 mitocondrial y la glucólisis10. La disfunción mitocondrial y los defectos de la glucólisis están implicados en enfermedades degenerativas de retinal11,12 y macular13, degeneración macular asociada a la edad10,14,15,16 y retinopatía diabética17,18. Por lo tanto, las mediciones precisas de la respiración mitocondrial y la glucólisis pueden proporcionar parámetros importantes para evaluar la integridad y la salud de la retina.
La respiración mitocondrial se puede medir a través de la determinación de la tasa de consumo de oxígeno (OCR). Dado que la conversión de glucosa en piruvato y posteriormente en lactato da como resultado la extrusión de protones y la acidificación del entorno extracelular, las mediciones de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) proporcionan una indicación del flujo de glucólisis. Como la retina está compuesta por múltiples tipos de células con relaciones íntimas y sinergia activa, incluido el intercambio de sustratos6, es imperativo analizar la función mitocondrial y el metabolismo en el contexto de todo el tejido retiniano con laminación y circuitos intactos. Durante las últimas décadas, los electrodos de O2 tipo Clark y otros microelectrodos de oxígeno se han utilizado para medir el consumo de oxígeno en la retina19,20,21. Estos electrodos de oxígeno tienen limitaciones importantes en la sensibilidad, el requisito de un gran volumen de muestra y la necesidad de agitación continua de la muestra en suspensión, lo que generalmente conduce a la interrupción del contexto celular y tisular. El protocolo descrito aquí se desarrolló utilizando una técnica de fluorescencia basada en microplacas para medir el metabolismo energético mitocondrial en tejido de retina de ratón ex vivo recién diseccionado. Permite mediciones en tiempo real de rendimiento medio de OCR y ECAR simultáneamente utilizando una pequeña muestra (punzón de 1 mm) de tejido retiniano ex vivo, evitando la necesidad de suspensión y agitación continua.
Aquí se demuestra el procedimiento experimental para el ensayo de estrés mitocondrial y el ensayo de tasa glucolítica en discos de punción retiniana recién diseccionados. Este protocolo permite la medición de las actividades metabólicas relacionadas con las mitocondrias en un contexto tisular ex vivo. A diferencia de los ensayos realizados con células cultivadas, las lecturas obtenidas aquí reflejan el metabolismo energético combinado a nivel tisular y están influenciadas por las interacciones entre los diferentes tipos de células dentro del tejido. El protocolo se modifica a partir de una versión publicada anteriormente22,23 para adaptarse a la nueva generación del analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse de 24 pocillos (XFe24) con placa de captura de islotes. El medio de ensayo, las concentraciones de compuestos de inyección y el número/duración de los ciclos de ensayo también se han optimizado para el tejido retiniano. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso para la preparación de discos perforados de retina. Se puede obtener más información sobre la configuración del programa y el análisis de datos en la guía del usuario del fabricante24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se proporcionan instrucciones detalladas para realizar ensayos basados en microplacas de la respiración mitocondrial y la actividad de la glucólisis utilizando discos perforadores de retina recién diseccionados ex vivo. El protocolo se ha optimizado para: 1) garantizar el uso de un medio de ensayo adecuado para el tejido retiniano ex vivo; 2) emplear el tamaño adecuado de los discos perforadores de retina para obtener lecturas de OCR y ECAR que se encuentren dentro del rango de detección ópt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional del Ojo (ZIAEY000450 y ZIAEY000546).
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
- Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
- Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
- Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
- Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
- Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
- Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
- Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
- Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
- Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
- Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
- Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
- Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
- Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
- Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
- Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
- Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
- . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
- . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
- . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
- . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
- Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
