Bepaling van mitochondriale ademhaling en glycolyse in ex vivo retinale weefselmonsters
Summary
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor het uitvoeren van mitochondriale stresstest en glycolytische snelheidstest in ex vivo retinale weefselmonsters met behulp van een commerciële bioanalyzer.
Abstract
Mitochondriale ademhaling is een kritieke energieopwekkende route in alle cellen, vooral retinale fotoreceptoren die een zeer actief metabolisme bezitten. Bovendien vertonen fotoreceptoren ook een hoge aerobe glycolyse zoals kankercellen. Nauwkeurige metingen van deze metabole activiteiten kunnen waardevolle inzichten verschaffen in cellulaire homeostase onder fysiologische omstandigheden en in ziektetoestanden. High throughput microplate-gebaseerde assays zijn ontwikkeld om mitochondriale ademhaling en verschillende metabole activiteiten in levende cellen te meten. Een overgrote meerderheid hiervan is echter ontwikkeld voor gekweekte cellen en is niet geoptimaliseerd voor intacte weefselmonsters en voor toepassing ex vivo. Hier wordt een gedetailleerd stapsgewijs protocol beschreven, met behulp van op microplaten gebaseerde fluorescentietechnologie, om het zuurstofverbruik (OCR) direct te meten als een indicator van mitochondriale ademhaling, evenals extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) als een indicator van glycolyse, in intact ex vivo retinaal weefsel. Deze methode is gebruikt om metabole activiteiten in het netvlies van volwassen muizen met succes te beoordelen en de toepassing ervan aan te tonen bij het onderzoeken van cellulaire mechanismen van veroudering en ziekte.
Introduction
Mitochondriën zijn essentiële organellen die het cellulaire metabolisme, signalering, homeostase en apoptose reguleren door meerdere cruciale fysiologische processen te coördineren1. Mitochondriën dienen als de krachtpatser in de cel om adenosinetrifosfaat (ATP) te genereren door oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en energie te leveren die bijna alle cellulaire gebeurtenissen ondersteunt. De meerderheid van cellulaire zuurstof wordt gemetaboliseerd in mitochondriën, waar het dient als de uiteindelijke elektronenacceptor in de elektronentransportketen (ETC) tijdens aerobe ademhaling. Lage hoeveelheden ATP kunnen ook worden geproduceerd door glycolyse in het cytosol, waar glucose wordt omgezet in pyruvaat, dat verder kan worden omgezet in lactaat of kan worden getransporteerd naar mitochondriën en geoxideerd tot acetyl-CoA, een substraat in de tricarbonzuurcyclus (TCA-cyclus).
Het netvlies is een van de meest metabolisch actieve weefsels bij zoogdieren2, met hoge niveaus van mitochondriale ademhaling en een extreem hoog zuurstofverbruik3. De staaf- en kegelfotoreceptoren bevatten een hoge dichtheid van mitochondriën4 en OXPHOS genereert de meeste ATP in het netvlies5. Daarnaast is het netvlies ook sterk afhankelijk van aerobe glycolyse6,7 door glucose om te zetten in lactaat5. Mitochondriale defecten worden geassocieerd met verschillende neurodegeneratieve ziekten8,9; en met zijn unieke hoge energiebehoeften is het netvlies bijzonder kwetsbaar voor metabole defecten, waaronder die welke mitochondriale OXPHOS4 en glycolyse beïnvloeden10. Mitochondriale disfunctie en defecten in glycolyse zijn betrokken bij retinale11,12 en maculaire13 degeneratieve ziekten, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie10,14,15,16 en diabetische retinopathie17,18. Daarom kunnen nauwkeurige metingen van mitochondriale ademhaling en glycolyse belangrijke parameters bieden voor het beoordelen van de integriteit en gezondheid van het netvlies.
Mitochondriale ademhaling kan worden gemeten door de bepaling van het zuurstofverbruik (OCR). Aangezien de omzetting van glucose in pyruvaat en vervolgens in lactaat resulteert in extrusie van protonen in en verzuring van de extracellulaire omgeving, geven metingen van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) een indicatie van glycolyseflux. Omdat het netvlies is samengesteld uit meerdere celtypen met intieme relaties en actieve synergie, inclusief de uitwisseling van substraten6, is het noodzakelijk om de mitochondriale functie en het metabolisme te analyseren in de context van het hele retinale weefsel met intacte laminering en circuits. De afgelopen decennia zijn de Clark type O2 elektroden en andere zuurstofmicro-elektroden gebruikt om het zuurstofverbruik in het netvlies te meten19,20,21. Deze zuurstofelektroden hebben grote beperkingen in gevoeligheid, vereiste van een groot monstervolume en de noodzaak van continu roeren van suspenderende monsters, wat meestal leidt tot de verstoring van de cellulaire en weefselcontext. Het hier beschreven protocol is ontwikkeld met behulp van een op microplaat gebaseerde fluorescentietechniek om mitochondriaal energiemetabolisme te meten in vers ontleed ex vivo netvliesweefsel van muizen. Het maakt real-time metingen van zowel OCR als ECAR met een gemiddelde doorvoer mogelijk, tegelijkertijd met behulp van een klein monster (1 mm pons) van ex vivo retinaal weefsel, terwijl de noodzaak van suspensie en continu roeren wordt vermeden.
Hier gedemonstreerd is de experimentele procedure voor mitochondriale stresstest en glycolytische snelheidstest op vers ontlede retinale ponsschijven. Dit protocol maakt het mogelijk om mitochondria-gerelateerde metabole activiteiten te meten in een ex vivo weefselcontext. Anders dan de testen die worden uitgevoerd met behulp van gekweekte cellen, weerspiegelen de hier verkregen metingen het gecombineerde energiemetabolisme op weefselniveau en worden ze beïnvloed door interacties tussen de verschillende celtypen in het weefsel. Het protocol is aangepast van een eerder gepubliceerde versie22,23 om zich aan te passen aan de nieuwe generatie van de Agilent Seahorse extracellulaire flux 24-wells (XFe24) analyzer met Islet Capture plaat. Het testmedium, de concentraties van injectieverbindingen en het aantal /de duur van de testcycli zijn ook geoptimaliseerd voor netvliesweefsel. Een gedetailleerd stap-voor-stap protocol wordt gegeven voor de voorbereiding van retinale ponsschijven. Meer informatie over het instellen van het programma en de gegevensanalyse is te vinden in de gebruikershandleiding van de fabrikant24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier worden gedetailleerde instructies gegeven voor het uitvoeren van microplaatgebaseerde assays van mitochondriale ademhaling en glycolyse-activiteit met behulp van ex vivo, vers ontlede retinale ponsschijven. Het protocol is geoptimaliseerd om: 1) te zorgen voor het gebruik van een geschikt testmedium voor ex vivo retinaal weefsel; 2) gebruik de juiste grootte van retinale ponsschijven om OCR- en ECAR-metingen te verkrijgen die binnen het optimale detectiebereik van de machine vallen; 3) coating mesh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Eye Institute (ZIAEY000450 en ZIAEY000546).
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
- Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
- Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
- Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
- Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
- Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
- Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
- Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
- Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
- Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
- Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
- Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
- Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
- Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
- Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
- Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
- Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
- . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
- . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
- . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
- . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
- Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
