Summary

Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120

Published: August 19, 2021
doi:

Summary

Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.

Abstract

Индуцируемые системы экспрессии генов являются бесценным инструментом для изучения биологических процессов. Оптогенетические системы экспрессии могут обеспечить точный контроль над временем экспрессии генов, местоположением и амплитудой, используя свет в качестве индуцированного агента. В этом протоколе оптогенетическая система экспрессии используется для достижения светоиндуцируемой экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио. Эта система опирается на инженерный фактор транскрипции под названием TAEL, основанный на естественном светоактивированном факторе транскрипции от бактерии E. litoralis. При освещении синим светом TAEL димеризуется, связывается со своим родственным регуляторным элементом, называемым C120, и активирует транскрипцию. Этот протокол использует трансгенные эмбрионы рыбок данио, которые экспрессируют фактор транскрипции TAEL под контролем вездесущего промотора ubb. В то же время регуляторный элемент C120 управляет экспрессией флуоресцентного репортерного гена (GFP). Используя простую светодиодную панель для подачи активирующего синего света, индукция экспрессии GFP может быть сначала обнаружена после 30 минут освещения и достигает пика более чем 130-кратной индукции после 3 ч световой обработки. Индукция экспрессии может быть оценена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и флуоресцентной микроскопии. Этот метод является универсальным и простым в использовании подходом к экспрессии оптогенетических генов.

Introduction

Индуцируемые системы экспрессии генов помогают контролировать количество, время и местоположение экспрессии генов. Однако достижение точного пространственного и временного контроля в многоклеточных организмах было сложной задачей. Временное управление чаще всего достигается путем добавления маломолекулярных соединений1 или активации промоутеров теплового шока2. Тем не менее, оба подхода уязвимы для вопросов времени, силы индукции и нецелевых стрессовых реакций. Пространственный контроль в основном достигается за счет использования тканеспецифических промоторов3,но такой подход требует подходящего промотора или регуляторного элемента, которые не всегда доступны, и это не способствует индукции субтафезневого уровня.

В отличие от таких традиционных подходов, активированные светом оптогенетические транскрипционные активаторы обладают потенциалом для более тонкого пространственного и временного контроля экспрессии генов4. Система TAEL/C120, реагирующая на синий свет, была разработана и оптимизирована для использования в эмбрионах рыбокданио5,6. Эта система основана на эндогенном светоактивированном транскрипционном факторе от бактерии E. litoralis7,8. Система TAEL/C120 состоит из транскрипционного активатора под названием TAEL, который содержит домен трансактивации Kal-TA4, чувствительный к синему свету домен LOV (измерение напряжения света-кислорода) и домен связывающей ДНК спирали-поворота-спирали (HTH)5. При освещении домены LOV претерпевают конформационное изменение, которое позволяет двум молекулам TAEL димеризоваться, связываться с TAEL-чувствительным промотором C120 и инициировать транскрипцию нижестоящего гена, представляющий интерес5,8. Система TAEL/C120 демонстрирует быструю и надежную индукцию с минимальной токсичностью и может быть активирована несколькими различными способами подачи света. Недавно были усовершенствования в системе TAEL/C120 путем добавления сигнала ядерной локализации в TAEL (TAEL-N) и соединения регулирующего элемента C120 с базальным промоутером cFos (C120F)(рисунок 1A). Эти модификации улучшили уровни индукции более чем в 15 разв 6раз.

В этом протоколе простая светодиодная панель используется для активации системы TAEL/C120 и индуцирования повсеместной экспрессии репортерного гена GFP. Индукцию экспрессии можно качественно контролировать, наблюдая интенсивность флуоресценции, или количественно путем измерения уровней транскриптов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол продемонстрирует систему TAEL/C120 как универсальный, простой в использовании инструмент, который обеспечивает надежную регуляцию экспрессии генов in vivo.

Protocol

Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Мерседе. 1. Скрещивание рыбок данио и сбор эмбрионов Поддерживайте отдельные трансгенные линии рыбок данио, содерж…

Representative Results

Для этой демонстрации реагирующая на C120 репортерная линия GFP(Tg(C120F:GFP)ucm107)была скрещена трансгенной линией, которая повсеместно экспрессирует TAEL-N из промотора ubiquitin b (ubb)(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113))для получения двойных трансгенных эмбрионов, содержащих оба элемента. Чер?…

Discussion

Этот протокол описывает использование оптогенетической системы TAEL/C120 для достижения экспрессии генов, индуцируемой синим светом. Эта система состоит из транскрипционного активатора TAEL, который димеризуется при освещении синим светом и активирует транскрипцию интересующего гена пос…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Стефана Матерну и членов лабораторий Woo и Materna за полезные предложения и комментарии по этому протоколу. Мы благодарим Анну Рид, Кевина Гарднера и Лору Мотта-Мена за ценную дискуссию и понимание при разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH; R03 DK106358) и Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета (CRN-20-636896) в S.W.

Materials

BioRender web-based science illustration tool BioRender https://biorender.com/
Color CCD digital camera Lumenara 755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D
Excitation filter, 545 nm Olympus ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE Healthcare 95017-491
Instsant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) Amazon B017GWDF7E
Methylcellulose Sigma-Aldrich M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch Amazon B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix Quantabio 101414-286
Photoshop image procesing software Adobe
Prism graphing and statistics software GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix Quantabio 10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28137
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source Excelitas 010-00326R Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

References

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).

Play Video

Cite This Article
LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. J. Vis. Exp. (174), e62818, doi:10.3791/62818 (2021).

View Video