Оптогенетика является мощным инструментом с широким спектром применения. Этот протокол демонстрирует, как достичь индуцируемой светом экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио с использованием системы TAEL/C120, реагирующей на синий свет.
Индуцируемые системы экспрессии генов являются бесценным инструментом для изучения биологических процессов. Оптогенетические системы экспрессии могут обеспечить точный контроль над временем экспрессии генов, местоположением и амплитудой, используя свет в качестве индуцированного агента. В этом протоколе оптогенетическая система экспрессии используется для достижения светоиндуцируемой экспрессии генов у эмбрионов рыбок данио. Эта система опирается на инженерный фактор транскрипции под названием TAEL, основанный на естественном светоактивированном факторе транскрипции от бактерии E. litoralis. При освещении синим светом TAEL димеризуется, связывается со своим родственным регуляторным элементом, называемым C120, и активирует транскрипцию. Этот протокол использует трансгенные эмбрионы рыбок данио, которые экспрессируют фактор транскрипции TAEL под контролем вездесущего промотора ubb. В то же время регуляторный элемент C120 управляет экспрессией флуоресцентного репортерного гена (GFP). Используя простую светодиодную панель для подачи активирующего синего света, индукция экспрессии GFP может быть сначала обнаружена после 30 минут освещения и достигает пика более чем 130-кратной индукции после 3 ч световой обработки. Индукция экспрессии может быть оценена с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и флуоресцентной микроскопии. Этот метод является универсальным и простым в использовании подходом к экспрессии оптогенетических генов.
Индуцируемые системы экспрессии генов помогают контролировать количество, время и местоположение экспрессии генов. Однако достижение точного пространственного и временного контроля в многоклеточных организмах было сложной задачей. Временное управление чаще всего достигается путем добавления маломолекулярных соединений1 или активации промоутеров теплового шока2. Тем не менее, оба подхода уязвимы для вопросов времени, силы индукции и нецелевых стрессовых реакций. Пространственный контроль в основном достигается за счет использования тканеспецифических промоторов3,но такой подход требует подходящего промотора или регуляторного элемента, которые не всегда доступны, и это не способствует индукции субтафезневого уровня.
В отличие от таких традиционных подходов, активированные светом оптогенетические транскрипционные активаторы обладают потенциалом для более тонкого пространственного и временного контроля экспрессии генов4. Система TAEL/C120, реагирующая на синий свет, была разработана и оптимизирована для использования в эмбрионах рыбокданио5,6. Эта система основана на эндогенном светоактивированном транскрипционном факторе от бактерии E. litoralis7,8. Система TAEL/C120 состоит из транскрипционного активатора под названием TAEL, который содержит домен трансактивации Kal-TA4, чувствительный к синему свету домен LOV (измерение напряжения света-кислорода) и домен связывающей ДНК спирали-поворота-спирали (HTH)5. При освещении домены LOV претерпевают конформационное изменение, которое позволяет двум молекулам TAEL димеризоваться, связываться с TAEL-чувствительным промотором C120 и инициировать транскрипцию нижестоящего гена, представляющий интерес5,8. Система TAEL/C120 демонстрирует быструю и надежную индукцию с минимальной токсичностью и может быть активирована несколькими различными способами подачи света. Недавно были усовершенствования в системе TAEL/C120 путем добавления сигнала ядерной локализации в TAEL (TAEL-N) и соединения регулирующего элемента C120 с базальным промоутером cFos (C120F)(рисунок 1A). Эти модификации улучшили уровни индукции более чем в 15 разв 6раз.
В этом протоколе простая светодиодная панель используется для активации системы TAEL/C120 и индуцирования повсеместной экспрессии репортерного гена GFP. Индукцию экспрессии можно качественно контролировать, наблюдая интенсивность флуоресценции, или количественно путем измерения уровней транскриптов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Этот протокол продемонстрирует систему TAEL/C120 как универсальный, простой в использовании инструмент, который обеспечивает надежную регуляцию экспрессии генов in vivo.
Этот протокол описывает использование оптогенетической системы TAEL/C120 для достижения экспрессии генов, индуцируемой синим светом. Эта система состоит из транскрипционного активатора TAEL, который димеризуется при освещении синим светом и активирует транскрипцию интересующего гена пос…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Стефана Матерну и членов лабораторий Woo и Materna за полезные предложения и комментарии по этому протоколу. Мы благодарим Анну Рид, Кевина Гарднера и Лору Мотта-Мена за ценную дискуссию и понимание при разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH; R03 DK106358) и Координационный комитет по исследованию рака Калифорнийского университета (CRN-20-636896) в S.W.
BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
Photoshop image procesing software | Adobe | ||
Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |