Optogenetics هو أداة قوية مع تطبيقات واسعة النطاق. يوضح هذا البروتوكول كيفية تحقيق التعبير الجيني الخفيف في أجنة سمك الحمار الوحشي باستخدام نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء.
نظم التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة العمليات البيولوجية. يمكن لأنظمة التعبير البصري أن توفر تحكما دقيقا في توقيت التعبير الجيني وموقعه وسعته باستخدام الضوء كعامل محفز. في هذا البروتوكول، يتم استخدام نظام التعبير البصري لتحقيق التعبير الجيني الخفيف القابل للانزدحام في أجنة حمار وحشي. يعتمد هذا النظام على عامل نسخ هندسي يسمى TAEL استنادا إلى عامل نسخ نشط للضوء بشكل طبيعي من بكتيريا E. litoralis. عندما تضيء مع الضوء الأزرق، TAEL dimerizes، يربط إلى عنصرها التنظيمي cognate يسمى C120، وينشط النسخ. يستخدم هذا البروتوكول أجنة حمار وحشي معدلة وراثيا تعبر عن عامل نسخ TAEL تحت سيطرة مروج ubb في كل مكان. وفي الوقت نفسه، فإن العنصر التنظيمي C120 يدفع التعبير عن جين المراسل الفلوري (GFP). باستخدام لوحة LED بسيطة لتقديم الضوء الأزرق المنشط ، يمكن أولا اكتشاف تحريض تعبير GFP بعد 30 دقيقة من الإضاءة ويصل إلى ذروة التعريفي أكثر من 130 ضعفا بعد 3 ساعة من العلاج الخفيف. يمكن تقييم تحريض التعبير عن طريق PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ومجهر الفلورسينس. هذه الطريقة هي نهج متعدد الاستخدامات وسهل الاستخدام للتعبير الجيني البصري.
تساعد أنظمة التعبير الجيني غير القابلة للانتهاك في التحكم في كمية التعبير الجيني وتوقيته وموقعه. ومع ذلك، كان تحقيق السيطرة المكانية والزمنية الدقيقة في الكائنات متعددة الخلايا أمرا صعبا. ويتحقق التحكم الزمني الأكثر شيوعا عن طريق إضافة مركبات جزيء صغير1 أو تفعيل المروجين صدمة الحرارة2. ومع ذلك، فإن كلا النهجين عرضة لقضايا التوقيت، وقوة الحث، والاستجابات الإجهادية خارج الهدف. ويتحقق التحكم المكاني بشكل رئيسي باستخدام المروجين3الخاصين بالأنسجة ، ولكن هذا النهج يتطلب مروجا مناسبا أو عنصرا تنظيميا ، وهو غير متوفر دائما ، ولا يؤدي إلى تحريض مستوى الأنسجة الفرعية.
وعلى النقيض من هذه النهج التقليدية، فإن المنشطات البصرية البصرية المنشطة للضوء لديها القدرة على التحكم المكاني والزمني الدقيق في التعبير الجيني4. تم تطوير نظام TAEL/C120 الأزرق المستجيب للضوء وتحسينه للاستخدام في أجنة حمار وحشي5،6. ويستند هذا النظام على عامل النسخ ضوء تنشيط الذاتية من البكتيريا E. litoralis7,8. يتكون نظام TAEL/C120 من منشط نسخي يسمى TAEL يحتوي على مجال تحويل Kal-TA4 ، ومجال LOV الأزرق المستجيب للضوء (استشعار الجهد الخفيف الأكسجين) ، ومجال ربط الحمض النووي الحلزوني (HTH)5. عندما مضيئة، والمجالات LOV الخضوع لتغيير تشكيلي يسمح اثنين من جزيئات TAEL لتعتيم، وربط إلى المروج C120 تستجيب TAEL، والشروع في نسخ من جين المصب منالفائدة 5،8. يعرض نظام TAEL/C120 تحريضا سريعا وقويا بأقل قدر من السمية ، ويمكن تنشيطه من خلال العديد من طرائق التسليم الخفيف المختلفة. وفي الآونة الأخيرة، أدخلت تحسينات على نظام TAEL/C120 بإضافة إشارة توطين نووية إلى TAEL (TAEL-N) وباقتران العنصر التنظيمي C120 بجهة تسويق أساسية cFos (C120F)(الشكل 1A). هذه التعديلات تحسين مستويات التعريفي بأكثر من 15 أضعاف6.
في هذا البروتوكول، يتم استخدام لوحة LED بسيطة لتنشيط نظام TAEL/C120 والحث على التعبير في كل مكان عن جين المراسل، GFP. يمكن رصد تحريض التعبير نوعيا من خلال مراقبة كثافة الفلورسينس أو كميا عن طريق قياس مستويات النسخ باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). هذا البروتوكول سوف تظهر نظام TAEL/C120 كأداة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام التي تمكن تنظيم قوي للتعبير الجيني في الجسم الحي.
يصف هذا البروتوكول استخدام نظام TAEL/C120 البصري لتحقيق التعبير الجيني الأزرق غير القابل للانخزال. يتكون هذا النظام من منشط النسخ ، TAEL ، الذي يتناقص عند الإضاءة مع الضوء الأزرق وينشط نسخ جين الفائدة في المصب لعنصر تنظيمي C120. يمكن الكشف عن التعبير المستحث لمراسل GFP بعد أقل من 30 دقيقة من التعرض ل?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ستيفان ماترنا وأعضاء مختبري وو وماتيرانا على الاقتراحات والتعليقات المفيدة على هذا البروتوكول. نشكر آنا ريد وكيفن غاردنر ولورا موتا مينا على المناقشات القيمة والرؤى أثناء تطوير هذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة؛ R03 DK106358) ولجنة تنسيق أبحاث السرطان بجامعة كاليفورنيا (CRN-20-636896) إلى S.W.
BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
Photoshop image procesing software | Adobe | ||
Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |