Summary

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

Published: August 19, 2021
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Summary

光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。

Abstract

誘導可能な遺伝子発現系は、生物学的プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。光遺伝学的発現系は、誘導剤として光を用いた遺伝子発現タイミング、位置、振幅を精密に制御できる。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成するために光遺伝学的発現系が用いられる。このシステムは、細菌 E.リトオラリスからの自然発生する光活性化転写因子に基づいてTAELと呼ばれる設計された転写因子に依存する。青色光で照らされると、TAELは二量体化し、C120と呼ばれるその同結合調節要素に結合し、転写を活性化する。このプロトコルは、ユビキタス ubb プロモーターの制御下でTAEL転写因子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用する。同時に、C120調節エレメントは、蛍光レポーター遺伝子(GFP)の発現を駆動します。青色光を活性化するシンプルなLEDパネルを使用して、GFP発現の誘導は、最初に30分後の照明の後に検出することができ、3時間の光処理後に130倍以上の誘導のピークに達します。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)および蛍光顕微鏡法により評価することができます。この方法は、光遺伝学的遺伝子発現のための多目的かつ使いやすいアプローチです。

Introduction

誘導可能な遺伝子発現システムは、遺伝子発現量、タイミング、位置を制御するのに役立ちます。しかし、多細胞生物の空間的・時間的制御を正確に行うのも困難でした。時間制御は、最も一般的には、低分子化合物1 またはヒートショックプロモーター2の活性化を加えることによって達成される。それでも、どちらのアプローチもタイミング、誘導強度、およびオフターゲットのストレス応答の問題に対して脆弱です。空間制御は、主に組織特異的プロモーター3の使用によって達成されるが、このアプローチは、常に利用可能ではない適切なプロモーターまたは調節要素を必要とし、サブ組織レベルの誘導を助長しない。

このような従来のアプローチとは対照的に、光活性化光遺伝学的転写活性化剤は、遺伝子発現の空間的および時間的制御を細かくする可能性を有する青色の光応答性TAEL/C120システムは、ゼブラフィッシュ胚5,6での使用に最適化された。このシステムは、細菌由来の細菌E.リソラリス7,8からの内因性光活性化転写因子に基づいている。TAEL/C120システムは、TAELと呼ばれる転写活性化剤で構成されており、これは、カル-TA4トランスアクティベートドメイン、青色光応答性LOV(光-酸素電圧センシング)ドメイン、およびらせん旋回らせん(HTH)DNA結合ドメイン5を含む。照射されると、LOVドメインは、2つのTAEL分子が二量体化し、TAEL応答性C120プロモーターに結合し、対象となる下流遺伝子の転写を開始することを可能にする立体構造変化を受ける5,8。TAEL/C120システムは、毒性を最小限に抑えた迅速かつ強い誘導を示し、いくつかの異なる光送達モダリティによって活性化することができます。最近、TAEL/C120系の改良は、核局在化シグナルをTAEL(TAEL-N)に加え、C120調節要素をcFos基底プロモーター(C120F)に結合させることによって行われた(図1A)。これらの改変は、誘導レベルを15倍以上6倍に改善した

このプロトコルでは、TAEL/C120システムを活性化し、レポーター遺伝子GFPのユビキタス発現を誘導するために、シンプルなLEDパネルが使用されます。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いて転写レベルを測定することにより、蛍光強度を観察するか定量的に観察することにより、定性的にモニタリングすることができる。このプロトコルは 、In vivoでの遺伝子発現の堅牢な調節を可能にする、多目的で使いやすいツールとしてTAEL/C120システムを実証する。

Protocol

この研究は、カリフォルニア大学マーセド校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。 1. ゼブラフィッシュの交差と胚のコレクション TAEL転写活性化剤またはC120制御レポーター遺伝子のいずれかを含む別々のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを維持し、スプリアス活性化を最小限に抑えます。 TAELとC120成分の両方を含む?…

Representative Results

このデモンストレーションでは、C120応答性GFPレポーターライン(Tg(C120F:GFP)ucm107)がユビキチンb(ubb)プロモーター(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)からTAEL-Nをユビキタスに表現するトランスジェニックラインと交差し、両方の要素を含む二重トランスジェニック胚を生成しました。24時間受精後、胚を青色光を活性化させることに曝され、1時間オン/1時間オフの頻度で?…

Discussion

このプロトコルは、光遺伝学的TAEL/C120系を用い、青色光誘導性遺伝子発現を達成することを説明する。このシステムは、青色光で照明時に二量体化し、C120調節要素の下流の対象遺伝子の転写を活性化する転写活性化剤TAELで構成されています。GFPレポーターの誘導発現は、わずか30分の光暴露後に検出することができ、このアプローチは比較的速く応答性の高い動態を有することを示唆してい…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ステファン・マテルナとウーとマテルナの研究室のメンバーに、このプロトコルに関する有益な提案とコメントに感謝します。アンナ・リード、ケビン・ガードナー、ローラ・モッタ・メナに感謝し、このプロトコルを開発しながら貴重な議論と洞察を得た。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金によって支えられた。R03 DK106358)とカリフォルニア大学がん研究調整委員会(CRN-20-636896)からS.W.

Materials

BioRender web-based science illustration tool BioRender https://biorender.com/
Color CCD digital camera Lumenara 755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D
Excitation filter, 545 nm Olympus ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE Healthcare 95017-491
Instsant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) Amazon B017GWDF7E
Methylcellulose Sigma-Aldrich M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch Amazon B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix Quantabio 101414-286
Photoshop image procesing software Adobe
Prism graphing and statistics software GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix Quantabio 10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28137
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source Excelitas 010-00326R Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

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Cite This Article
LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. J. Vis. Exp. (174), e62818, doi:10.3791/62818 (2021).

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