Summary

Expressão GFP induzida pela luz em embriões de zebrafish usando o sistema OPtogenético TAEL/C120

Published: August 19, 2021
doi:

Summary

Optogenética é uma ferramenta poderosa com aplicações abrangentes. Este protocolo demonstra como alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish usando o sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul.

Abstract

Sistemas de expressão genética indutíveis são uma ferramenta inestimável para estudar processos biológicos. Sistemas de expressão optogenética podem fornecer controle preciso sobre o tempo, localização e amplitude da expressão genética usando a luz como agente indutor. Neste protocolo, um sistema de expressão optogenética é usado para alcançar a expressão genética indutível à luz em embriões de zebrafish. Este sistema se baseia em um fator de transcrição projetado chamado TAEL baseado em um fator de transcrição ativado pela luz natural da bactéria E. litoralis. Quando iluminado com luz azul, o TAEL escurece, liga-se ao seu elemento regulatório cognato chamado C120 e ativa a transcrição. Este protocolo utiliza embriões transgênicos de zebrafish que expressam o fator de transcrição do TAEL sob o controle do onipresente promotor ubb. Ao mesmo tempo, o elemento regulatório C120 impulsiona a expressão de um gene repórter fluorescente (GFP). Usando um simples painel LED para fornecer luz azul ativante, a indução da expressão GFP pode ser detectada primeiro após 30 minutos de iluminação e atinge um pico de mais de 130 vezes de indução após 3h de tratamento leve. A indução de expressão pode ser avaliada por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e por microscopia de fluorescência. Este método é uma abordagem versátil e fácil de usar para a expressão genética optogenética.

Introduction

Sistemas de expressão genética indutíveis ajudam a controlar a quantidade, o tempo e a localização da expressão genética. No entanto, alcançar o controle espacial e temporal exato em organismos multicelulares tem sido desafiador. O controle temporal é mais comumente alcançado adicionando compostos de pequenas moléculas1 ou ativação dos promotores de choque térmico2. Ainda assim, ambas as abordagens são vulneráveis a questões de tempo, força de indução e respostas de estresse fora do alvo. O controle espacial é alcançado principalmente pelo uso de promotores específicos do tecido3,mas essa abordagem requer um promotor adequado ou elemento regulatório, que nem sempre estão disponíveis, e não é propício à indução do nível subsecimento.

Em contraste com tais abordagens convencionais, ativadores transcricionais optogenéticos ativados pela luz têm o potencial de um controle espacial e temporal mais fino da expressãogenética 4. O sistema TAEL/C120 de resposta à luz azul foi desenvolvido e otimizado para uso em embriões de zebrafish5,6. Este sistema é baseado em um fator de transcrição endógeno ativado pela luz da bactéria E. litoralis7,8. O sistema TAEL/C120 consiste em um ativador transcricional chamado TAEL que contém um domínio de transativação Kal-TA4, um domínio LOV lov (sensor de tensão de luz-oxigênio) azul e um domínio de ligação de DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando iluminados, os domínios LOV sofrem uma alteração conformacional que permite que duas moléculas de TAEL dimerizem, vinculem-se a um promotor C120 responsivo do TAEL e iniciem a transcrição de um gene a jusante de interesse5,8. O sistema TAEL/C120 apresenta indução rápida e robusta com toxicidade mínima, podendo ser ativado por diversas modalidades diferentes de entrega de luz. Recentemente, foram feitas melhorias no sistema TAEL/C120, adicionando um sinal de localização nuclear ao TAEL (TAEL-N) e acoplando o elemento regulatório C120 a um promotor basal cFos (C120F) (Figura 1A). Essas modificações melhoraram os níveis de indução em mais de 15vezes 6.

Neste protocolo, um simples painel LED é usado para ativar o sistema TAEL/C120 e induzir a expressão onipresente de um gene repórter, GFP. A indução de expressão pode ser monitorada qualitativamente observando a intensidade da fluorescência ou quantitativamente medindo os níveis de transcrição usando PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR). Este protocolo demonstrará o sistema TAEL/C120 como uma ferramenta versátil e fácil de usar que permite uma regulação robusta da expressão genética in vivo.

Protocol

Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Califórnia Merced. 1. Travessia de zebrafish e coleta de embriões Mantenha linhas separadas de zebrafish transgênicos contendo o ativador transcricional TAEL ou o gene repórter controlado pelo C120 para minimizar a ativação espúria. Cruze 6-8 zebrafish adultos de cada linha usando métodos padrão9 para produzir embriõe…

Representative Results

Para esta demonstração, uma linha de repórteres GFP responsiva C120 -responsiva (Tg(C120F:GFP)ucm107)foi cruzada com uma linha transgênica que expressa TAEL-N onipresentemente a partir da ubiquitina b (ubb) promotor(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) para produzir embriões transgênicos duplos contendo ambos os elementos. 24 h pós-fertilização, os embriões foram expostos à ativação da luz azul, pulsado a uma frequência de 1 h on/1 h off. A indução da expressão…

Discussion

Este protocolo descreve o uso do sistema optogenético TAEL/C120 para alcançar a expressão genética indutível da luz azul. Este sistema consiste em um ativador transcricional, TAEL, que escurece após a iluminação com luz azul e ativa a transcrição de um gene de interesse a jusante de um elemento regulatório C120. A expressão induzida de um repórter do GFP pode ser detectada após apenas 30 minutos de exposição à luz, sugerindo que essa abordagem possui cinética relativamente rápida e responsiva.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Stefan Materna e aos membros dos laboratórios Woo e Materna por sugestões úteis e comentários sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena por valiosas discussões e insights enquanto desenvolvem este protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH; R03 DK106358) e o Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia (CRN-20-636896) para s.W.

Materials

BioRender web-based science illustration tool BioRender https://biorender.com/
Color CCD digital camera Lumenara 755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD Thorlabs PM100D
Excitation filter, 545 nm Olympus ET545/25x
illustra RNAspin Mini kit GE Healthcare 95017-491
Instsant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) Amazon B017GWDF7E
Methylcellulose Sigma-Aldrich M7140
NEARPOW Programmable digital timer switch Amazon B01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mix Quantabio 101414-286
Photoshop image procesing software Adobe
Prism graphing and statistics software GraphPad
qScript XLT cDNA SuperMix Quantabio 10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28137
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich E10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light source Excelitas 010-00326R Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

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Cite This Article
LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. J. Vis. Exp. (174), e62818, doi:10.3791/62818 (2021).

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