Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120
Summary
L’optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l’espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.
Abstract
I sistemi di espressione genica inducibili sono uno strumento inestimabile per lo studio dei processi biologici. I sistemi di espressione optogenetica possono fornire un controllo preciso sui tempi, la posizione e l’ampiezza dell’espressione genica utilizzando la luce come agente induttore. In questo protocollo, un sistema di espressione optogenetica viene utilizzato per ottenere l’espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione ingegnerizzato chiamato TAEL basato su un fattore di trascrizione attivato dalla luce naturale dal batterio E. litoralis. Quando illuminato con luce blu, TAEL dimerizza, si lega al suo elemento regolatore affine chiamato C120 e attiva la trascrizione. Questo protocollo utilizza embrioni transgenici di zebrafish che esprimono il fattore di trascrizione TAEL sotto il controllo dell’onnipresente promotore ubb. Allo stesso tempo, l’elemento regolatore C120 guida l’espressione di un gene reporter fluorescente (GFP). Utilizzando un semplice pannello LED per fornire luce blu attivante, l’induzione dell’espressione GFP può essere rilevata per la prima volta dopo 30 minuti di illuminazione e raggiunge un picco di oltre 130 volte l’induzione dopo 3 ore di trattamento della luce. L’induzione dell’espressione può essere valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e microscopia a fluorescenza. Questo metodo è un approccio versatile e facile da usare per l’espressione genica optogenetica.
Introduction
I sistemi di espressione genica inducibili aiutano a controllare la quantità, i tempi e la posizione dell’espressione genica. Tuttavia, ottenere l’esatto controllo spaziale e temporale negli organismi multicellulari è stato difficile. Il controllo temporale è più comunemente ottenuto aggiungendo composti a piccole molecole1 o attivazione di promotori di shock termici2. Tuttavia, entrambi gli approcci sono vulnerabili a problemi di tempistica, forza di induzione e risposte allo stress fuori bersaglio. Il controllo spaziale si ottiene principalmente con l’uso di promotori tessuto-specifici3, ma questo approccio richiede un promotore o un elemento normativo adeguato, che non sono sempre disponibili e non è favorevole all’induzione a livello sub-tissutale.
In contrasto con tali approcci convenzionali, gli attivatori trascrizionali optogenetici attivati dalla luce hanno il potenziale per un controllo spaziale e temporale più fine dell’espressionegenica 4. Il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu è stato sviluppato e ottimizzato per l’uso in embrioni di zebrafish5,6. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione endogeno attivato dalla luce dal batterio E. litoralis7,8. Il sistema TAEL/C120 è costituito da un attivatore trascrizionale chiamato TAEL che contiene un dominio di transattivazione Kal-TA4, un dominio LOV (light-oxygen-voltage sensing) sensibile alla luce blu e un dominio di legame al DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando illuminati, i domini LOV subiscono un cambiamento conformazionale che consente a due molecole TAEL di dimerizzare, legarsi a un promotore C120 responso al TAEL e avviare la trascrizione di un gene a valle di interesse5,8. Il sistema TAEL/C120 presenta un’induzione rapida e robusta con una tossicità minima e può essere attivato da diverse modalità di erogazione della luce. Recentemente, sono stati apportati miglioramenti al sistema TAEL/C120 aggiungendo un segnale di localizzazione nucleare a TAEL (TAEL-N) e accoppiando l’elemento regolatore C120 a un promotore basale cFos (C120F) (Figura 1A). Queste modifiche hanno migliorato i livelli di induzione di oltre 15 volte6.
In questo protocollo, un semplice pannello LED viene utilizzato per attivare il sistema TAEL/C120 e indurre l’espressione ubiquitaria di un gene reporter, GFP. L’induzione dell’espressione può essere monitorata qualitativamente osservando l’intensità della fluorescenza o quantitativamente misurando i livelli di trascrizione utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Questo protocollo dimostrerà il sistema TAEL/C120 come uno strumento versatile e facile da usare che consente una robusta regolazione dell’espressione genica in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’uso del sistema optogenetico TAEL/C120 per ottenere l’espressione genica inducibile dalla luce blu. Questo sistema è costituito da un attivatore trascrizionale, TAEL, che dimerizza all’illuminazione con luce blu e attiva la trascrizione di un gene di interesse a valle di un elemento regolatore C120. L’espressione indotta di un reporter GFP può essere rilevata dopo appena 30 minuti di esposizione alla luce, suggerendo che questo approccio possiede una cinetica relativamente veloce e reattiva…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Stefan Materna e i membri dei laboratori Woo e Materna per utili suggerimenti e commenti su questo protocollo. Ringraziamo Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena per preziose discussioni e approfondimenti durante lo sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) e il Comitato di coordinamento della ricerca sul cancro dell’Università della California (CRN-20-636896) a S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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