Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120
Summary
La optogenética es una herramienta poderosa con una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo demuestra cómo lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul.
Abstract
Los sistemas de expresión génica inducibles son una herramienta invaluable para estudiar los procesos biológicos. Los sistemas de expresión optogenética pueden proporcionar un control preciso sobre el tiempo, la ubicación y la amplitud de la expresión génica utilizando la luz como agente inductor. En este protocolo, se utiliza un sistema de expresión optogenética para lograr la expresión génica inducible por la luz en embriones de pez cebra. Este sistema se basa en un factor de transcripción diseñado llamado TAEL basado en un factor de transcripción activado por la luz natural de la bacteria E. litoralis. Cuando se ilumina con luz azul, TAEL se dimeriza, se une a su elemento regulador cognado llamado C120 y activa la transcripción. Este protocolo utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan el factor de transcripción TAEL bajo el control del omnipresente promotor ubb. Al mismo tiempo, el elemento regulador C120 impulsa la expresión de un gen reportero fluorescente (GFP). Utilizando un panel LED simple para entregar luz azul activadora, la inducción de la expresión de GFP se puede detectar primero después de 30 minutos de iluminación y alcanza un pico de inducción de más de 130 veces después de 3 h de tratamiento de luz. La inducción de la expresión puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y mediante microscopía de fluorescencia. Este método es un enfoque versátil y fácil de usar para la expresión génica optogenética.
Introduction
Los sistemas de expresión génica inducibles ayudan a controlar la cantidad, el momento y la ubicación de la expresión génica. Sin embargo, lograr un control espacial y temporal exacto en organismos multicelulares ha sido un desafío. El control temporal se logra más comúnmentemediante la adición de compuestos de moléculas pequeñas 1 o la activación de promotores de choquetérmico 2. Aún así, ambos enfoques son vulnerables a problemas de tiempo, fuerza de inducción y respuestas de estrés fuera del objetivo. El control espacial se logra principalmente mediante el uso de promotores específicos de tejidos3, pero este enfoque requiere un promotor o elemento regulador adecuado, que no siempre está disponible, y no es propicio para la inducción a nivel de subsulares.
En contraste con tales enfoques convencionales, los activadores transcripcionales optogenéticos activados por la luz tienen el potencial de un control espacial y temporal más fino de la expresióngénica 4. El sistema TAEL/C120 sensible a la luz azul fue desarrollado y optimizado para su uso en embriones de pez cebra5,6. Este sistema se basa en un factor de transcripción endógeno activado por la luz de la bacteria E. litoralis7,8. El sistema TAEL/C120 consiste en un activador transcripcional llamado TAEL que contiene un dominio de transactivación Kal-TA4, un dominio LOV (detección de luz-oxígeno-voltaje) sensible a la luz azul y un dominio de unión al ADN de hélice-giro-hélice (HTH)5. Cuando se iluminan, los dominios LOV sufren un cambio conformacional que permite que dos moléculas TAEL se dimericen, se unan a un promotor C120 sensible a TAEL e inicien la transcripción de un gen de interés aguasabajo 5,8. El sistema TAEL/C120 exhibe una inducción rápida y robusta con una toxicidad mínima, y puede ser activado por varias modalidades diferentes de suministro de luz. Recientemente, se realizaron mejoras en el sistema TAEL/C120 agregando una señal de localización nuclear a TAEL (TAEL-N) y acoplando el elemento regulador C120 a un promotor basal cFos (C120F)(Figura 1A). Estas modificaciones mejoraron los niveles de inducción en más de 15 veces6.
En este protocolo, se utiliza un panel LED simple para activar el sistema TAEL/C120 e inducir la expresión ubicua de un gen reportero, GFP. La inducción de la expresión se puede monitorear cualitativamente observando la intensidad de la fluorescencia o cuantitativamente midiendo los niveles de transcripción utilizando PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Este protocolo demostrará el sistema TAEL/C120 como una herramienta versátil y fácil de usar que permite una regulación robusta de la expresión génica in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso del sistema optogenético TAEL/C120 para lograr la expresión génica inducible por la luz azul. Este sistema consiste en un activador transcripcional, TAEL, que se dimeriza al iluminar con luz azul y activa la transcripción de un gen de interés aguas abajo de un elemento regulador C120. La expresión inducida de un reportero GFP se puede detectar después de tan solo 30 minutos de exposición a la luz, lo que sugiere que este enfoque posee una cinética relativamente rápida y receptiva….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Stefan Materna y a los miembros de los laboratorios Woo y Materna por sus útiles sugerencias y comentarios sobre este protocolo. Agradecemos a Anna Reade, Kevin Gardner y Laura Motta-Mena por su valiosa discusión y conocimientos durante el desarrollo de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH; R03 DK106358) y el Comité Coordinador de Investigación del Cáncer de la Universidad de California (CRN-20-636896) a S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
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