2D и 3D индуцированные человеком плюрипотентные модели на основе стволовых клеток для рассечения первичного поражения ресничек во время неокортикального развития
Summary
Мы представляем подробные протоколы для генерации и характеристики 2D и 3D моделей неокортикального развития на основе 2D и 3D индуцированных человеком стволовых клеток (hIPSC), а также дополнительные методологии, позволяющие качественно и количественно анализировать биогенез и функцию первичной реснички (ПК).
Abstract
Первичные реснички (ПК) представляют собой неподвижные динамические органеллы на основе микротрубочек, которые выступают из поверхности большинства клеток млекопитающих. Они выходят из более старой центриолы во время фазы G1 / G0 клеточного цикла, в то время как они разбираются, когда клетки возвращаются в клеточный цикл на границе фазы G2 / M. Они функционируют как концентраторы сигналов, обнаруживая и преобразуя внеклеточные сигналы, имеющие решающее значение для многих клеточных процессов. Как и в большинстве типов клеток, все неокортикальные нервные стволовые и прогениторные клетки (НСПК) содержат ПК, позволяющий им ощущать и передавать специфические сигналы, необходимые для нормального развития коры головного мозга. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для создания и характеристики двумерных (2D) и трехмерных (3D) клеточных моделей из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC) для дальнейшего анализа участия ПК во время неокортикального развития. В частности, мы представляем протоколы для изучения биогенеза и функции ПК в 2D-нейронных розетках NFPC, включая трансдукцию пути Sonic Hedgehog (SHH). Чтобы воспользоваться преимуществами трехмерной (3D) организации церебральных органоидов, мы опишем простой метод 3D-визуализации иммуноструктурированных церебральных органоидов. После оптической очистки быстрое получение целых органоидов позволяет обнаруживать как центросомы, так и ПК на неокортикальных предшественниках и нейронах всего органоида. Наконец, мы подробно описываем процедуру иммуноокрашения и очистки толстых свободно плавающих органоидных срезов, сохраняющих значительную степень пространственной 3D-информации и позволяющих получать данные с высоким разрешением, необходимые для детального качественного и количественного анализа биогенеза и функции ПК.
Introduction
Первичные реснички (ПК) представляют собой органеллы на основе микротрубочек, которые чувствуют и передают множество химических и механических сигналов из внеклеточной среды. В частности, ПК является центральной органеллой для трансдукции сигнального пути Ежа у позвоночных1,2. В то время как большинство нервных клеток уже давно имеют ПК, вклад этой органеллы в формирование центральной нервной системы уже давно недооценен. Исследования неокортикального развития привели к открытию нескольких нервных стволовых и прародительных клеток (НСПК), все из которых содержат ПК, местоположение которого, как было предложено, имеет решающее значение для определения судьбы прародителя3,4,5,6,7. Было показано, что ПК имеет решающее значение для клеточных механизмов, которые необходимы для нормального развития коры головного мозга, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также апикобазальную полярность радиального глиального каркаса, поддерживающего миграцию нейронов13. Кроме того, ПК требуются при тангенциальной миграции интернейронов на кортикальную пластину14,15. Наконец, предложена роль ПК в установлении синаптических связей нейронов в коре головного мозга16,17. В целом, эти результаты доказывают решающую роль ПК на основных этапах развития коры головного мозга18,19 и повышают необходимость исследования их участия в патологических механизмах, лежащих в основе аномалий развития коры головного мозга.
Недавние исследования в значительной степени улучшили наше понимание важных клеточных и молекулярных различий между развитием коры в моделях человека и животных, подчеркнув необходимость разработки модельных систем человека. С этой точки зрения, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC) представляют собой многообещающий подход к изучению патогенеза заболеваний в соответствующем генетическом и клеточном контексте. Адгезивные двумерные (2D) клеточные модели или нейронные розетки содержат НСПК, аналогичные тем, которые наблюдаются в развивающейся коре головного мозга, которые организуются в розеткообразные структуры, показывающие правильную апикобазальную полярность20,21,22. Кроме того, трехмерная (3D) система культивирования позволяет генерировать органоиды дорсального переднего мозга, которые повторяют многие особенности развития коры головного мозга человека23,24,25,26. Эти два комплементарных подхода к моделированию на основе клеток предлагают захватывающие перспективы для препарирования участия ПК во время нормального и патологического развития коры головного мозга.
Здесь мы предоставляем подробные протоколы для генерации и характеристики нейронных розеток и производных НСПК, а также органоидов дорсального переднего мозга. Мы также предоставляем подробные протоколы для анализа биогенеза и функции ПК, присутствующего на НСПК, путем тестирования трансдукции пути Sonic Hedgehog и анализа динамики ключевых молекул, участвующих в этом пути. Чтобы воспользоваться преимуществами 3D-организации церебральных органоидов, мы также создали простой и экономически эффективный метод 3D-визуализации иммуноокрашенных церебральных органоидов, позволяющий быстро получать, благодаря световому листовому микроскопу, весь органоид с высоким разрешением, позволяющим визуализировать ПК на всех типах неокортикальных предшественников и нейронов всего органоида. Наконец, мы адаптировали иммуногистохимию на свободно плавающих участках 150 мкм с последующей очисткой и получением с помощью резонансного сканирующего конфокального микроскопа, позволяющего получать изображения с высоким разрешением, что необходимо для детального анализа биогенеза и функции ПК. В частности, программное обеспечение для 3D-визуализации позволяет осуществлять 3D-реконструкцию ПК с последующим анализом морфологических параметров, включая длину, количество и ориентацию ПК, а также измерение интенсивности сигнала цилиарных компонентов вдоль аксонемы.
Protocol
Representative Results
Discussion
ПК в настоящее время рассматриваются как ключевые органеллы, регулирующие важнейшие этапы нормального развития коры головного мозга18,19,31, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Национального агентства исследований (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) и N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 и ANR-19-CE16-0002-01). LB поддерживается ANR в рамках программы Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) и Фондом Бетанкур Шуллер (программа MD-PhD). Институт Imagine поддерживается государственным финансированием ANR в рамках программы Investissements d’avenir (проекты ANR-10-IAHU-01, CrossLab) и в рамках второй программы Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
