2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung
Summary
Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.
Abstract
Primäre Zilien (PC) sind nicht bewegliche dynamische Organellen auf Mikrotubulibasis, die aus der Oberfläche der meisten Säugetierzellen herausragen. Sie treten während der G1/G0-Phase des Zellzyklus aus dem älteren Zentriole aus, während sie sich zerlegen, wenn die Zellen an der G2/M-Phasengrenze wieder in den Zellzyklus eintreten. Sie fungieren als Signalknotenpunkte, indem sie extrazelluläre Signale erkennen und transduzieren, die für viele Zellprozesse entscheidend sind. Ähnlich wie bei den meisten Zelltypen wurde gezeigt, dass alle neokortikalen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) einen PC beherbergen, der es ihnen ermöglicht, spezifische Signale zu erfassen und zu übertragen, die für die normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) zellbasierte Modelle aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSCs) zu generieren und zu charakterisieren, um die Beteiligung von PC während der neokortikalen Entwicklung weiter zu analysieren. Insbesondere stellen wir Protokolle vor, um die PC-Biogenese und -Funktion in 2D-neuronalen Rosetten-abgeleiteten NSPCs zu untersuchen, einschließlich der Transduktion des Sonic Hedgehog (SHH) -Signalwegs. Um die dreidimensionale (3D) Organisation von zerebralen Organoiden zu nutzen, beschreiben wir eine einfache Methode zur 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden. Nach dem optischen Clearing ermöglicht die schnelle Erfassung ganzer Organoide den Nachweis von Zentrosomen und PC auf neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids. Schließlich beschreiben wir das Verfahren zur Immunfärbung und Klärung dicker frei schwebender Organoidabschnitte, die ein erhebliches Maß an räumlicher 3D-Information erhalten und die hochauflösende Erfassung ermöglichen, die für die detaillierte qualitative und quantitative Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist.
Introduction
Primäre Zilien (PC) sind auf Mikrotubuli basierende Organellen, die eine Fülle von chemischen und mechanischen Hinweisen aus der extrazellulären Umgebung wahrnehmen und übertragen. Insbesondere ist PC die zentrale Organelle für die Transduktion des Hedgehog-Signalwegs bei Wirbeltieren1,2. Während die meisten Nervenzellen seit langem gezeigt wurden, dass sie einen PC beherbergen, wurde der Beitrag dieser Organelle bei der Gestaltung des zentralen Nervensystems lange Zeit unterschätzt. Studien zur neokortikalen Entwicklung haben zur Entdeckung mehrerer neuraler Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) geführt, die alle einen PC beherbergen, dessen Standort als entscheidend für die Bestimmung des Schicksals des Vorläufers angesehen wurde3,4,5,6,7. PC hat sich als entscheidend für Zellmechanismen erwiesen, die für eine normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind, einschließlich NSPC-Expansion und –Engagement8,9,10,11,12 sowie apikobasaler Polarität des radialen Gliagerüsts zur Unterstützung der neuronalen Migration13. Darüber hinaus werden PC während der tangentialen Wanderung von Interneuronen zur kortikalen Platte benötigt14,15. Schließlich wurde eine Rolle für den PC bei der Herstellung synaptischer Verbindungen von Neuronen in der Großhirnrinde vorgeschlagen16,17. Insgesamt sprechen diese Ergebnisse für eine entscheidende Rolle von PC bei wichtigen Schritten der zerebralen kortikalen Entwicklung18,19 und erhöhen die Notwendigkeit, ihre Beteiligung an den pathologischen Mechanismen zu untersuchen, die Anomalien der zerebralen kortikalen Entwicklung zugrunde liegen.
Jüngste Studien haben unser Verständnis wichtiger zellulärer und molekularer Unterschiede zwischen kortikaler Entwicklung in menschlichen und tierischen Modellen erheblich verbessert und die Notwendigkeit der Entwicklung menschlicher Modellsysteme betont. Aus dieser Sicht stellen humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSCs) einen vielversprechenden Ansatz dar, um die Krankheitspathogenese in einem relevanten genetischen und zellulären Kontext zu untersuchen. Adhärente zweidimensionale (2D) zellbasierte Modelle oder neuronale Rosetten enthalten NSPCs, die denen in der sich entwickelnden Großhirnrinde ähneln, die sich in rosettenförmigen Strukturen organisieren, die eine korrekte apikobasale Polarität aufweisen20,21,22. Darüber hinaus ermöglicht das dreidimensionale (3D) Kultursystem die Erzeugung dorsaler Organoide des Vorderhirns, die viele Merkmale der menschlichen zerebralen kortikalen Entwicklung rekapitulieren23,24,25,26. Diese beiden komplementären zellbasierten Modellierungsansätze bieten spannende Perspektiven, um die Beteiligung von PC während der normalen und pathologischen Entwicklung der Großhirnrinde zu analysieren.
Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von neuronalen Rosetten und abgeleiteten NSPCs sowie dorsalen Vorderhirn-Organoiden zur Verfügung. Wir bieten auch detaillierte Protokolle zur Analyse der Biogenese und Funktion von PCs auf NSPCs, indem wir die Transduktion des Sonic Hedgehog-Signalwegs testen und die Dynamik entscheidender Moleküle analysieren, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Um die Vorteile der 3D-Organisation der zerebralen Organoide zu nutzen, haben wir auch eine einfache und kostengünstige Methode für die 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden eingerichtet, die dank eines Lichtblattmikroskops eine schnelle Erfassung des gesamten Organoids mit hoher Auflösung ermöglicht, die es ermöglicht, PC auf allen Arten von neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids zu visualisieren. Schließlich passten wir die Immunhistochemie auf 150 μm frei schwebenden Schnitten mit anschließender Klärung und Erfassung mit resonanten Scanning-Konfokalmikroskopen an, die eine hochauflösende Bildaufnahme ermöglichten, die für die detaillierte Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist. Insbesondere ermöglicht die 3D-Bildgebungssoftware die 3D-Rekonstruktion des PCs mit anschließender Analyse morphologischer Parameter einschließlich Länge, Anzahl und Ausrichtung des PCs sowie die Messung der Signalintensität von Ziliarkomponenten entlang des Axonems.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC werden heute als Schlüsselorganellen angesehen, die entscheidende Schritte während der normalen zerebralen kortikalen Entwicklung regulieren18,19,31 einschließlich NSPC-Expansion und -Engagement8,9,10,11,12 sowie neuronale Migration13,14<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR) an S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) und N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 und ANR-19-CE16-0002-01) unterstützt. LB wird vom ANR im Rahmen des Programms Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) und der Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-Programm) unterstützt. Das Imagine Institute wird durch staatliche Mittel des ANR im Rahmen des Programms Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-Projekte) und im Rahmen des zweiten Programms Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002) unterstützt.
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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