Modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per sezionare il coinvolgimento primario del cilio durante lo sviluppo neocorticale
Summary
Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l’analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).
Abstract
Le ciglia primarie (PC) sono organelli dinamici non mobili a base di microtubuli che sporgono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. Emergono dal centriolo più vecchio durante la fase G1/G0 del ciclo cellulare, mentre si disassemblano quando le cellule rientrano nel ciclo cellulare al limite di fase G2/M. Funzionano come hub di segnale, rilevando e trasducendo segnali extracellulari cruciali per molti processi cellulari. Simile alla maggior parte dei tipi di cellule, tutte le cellule staminali neurali neocorticali e progenitrici (NSPC) hanno dimostrato di ospitare un PC che consente loro di percepire e trasdurre segnali specifici necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale. Qui, forniamo protocolli dettagliati per generare e caratterizzare modelli cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) per sezionare ulteriormente il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo neocorticale. In particolare, presentiamo protocolli per studiare la biogenesi e la funzione del PC in NSPC derivati da rosette neurali 2D, inclusa la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog (SHH). Per sfruttare l’organizzazione tridimensionale (3D) degli organoidi cerebrali, descriviamo un metodo semplice per l’imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto . Dopo la compensazione ottica, la rapida acquisizione di interi organoidi consente il rilevamento sia di centrosomi che di PC su progenitori neocorticali e neuroni dell’intero organoide. Infine, descriviamo in dettaglio la procedura per l’immunocolorazione e la pulizia di spesse sezioni organoidi fluttuanti che preservano un grado significativo di informazioni spaziali 3D e consentendo l’acquisizione ad alta risoluzione necessaria per l’analisi qualitativa e quantitativa dettagliata della biogenesi e della funzione del PC.
Introduction
Le ciglia primarie (PC) sono organelli a base di microtubuli che percepiscono e trasducono una pletora di segnali chimici e meccanici dall’ambiente extracellulare. In particolare, il PC è l’organello centrale per la trasduzione della via di segnalazione hedgehog nei vertebrati1,2. Mentre la maggior parte delle cellule neurali ha dimostrato a lungo di ospitare un PC, il contributo di questo organello nel modellare il sistema nervoso centrale è stato a lungo sottovalutato. Gli studi sullo sviluppo neocorticale hanno portato alla scoperta di cellule staminali neurali multiple e progenitrici (NSPC), tutte dotate di PC, la cui posizione è stata proposta come cruciale per la determinazione del destino progenitore3,4,5,6,7. Il PC si è dimostrato cruciale per i meccanismi cellulari necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale, tra cui l’espansione e l’impegno NSPC8,9,10,11,12 e la polarità apicobasale dello scaffold gliale radiale che supporta la migrazione neuronale13. Inoltre, i PC sono necessari durante la migrazione tangenziale degli interneuroni alla piastra corticale14,15. Infine, è stato proposto un ruolo per il PC nella creazione di connessioni sinaptiche dei neuroni nella corteccia cerebrale16,17. Complessivamente, questi risultati sostengono un ruolo cruciale della PC nelle fasi principali dello sviluppo corticale cerebrale18,19 e sollevano la necessità di indagare il loro coinvolgimento nei meccanismi patologici alla base delle anomalie dello sviluppo corticale cerebrale.
Studi recenti hanno ampiamente migliorato la nostra comprensione di importanti differenze cellulari e molecolari tra lo sviluppo corticale in modelli umani e animali, sottolineando la necessità di sviluppare sistemi modello umani. In questa prospettiva, le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (hIPSC) rappresentano un approccio promettente per studiare la patogenesi della malattia in un contesto genetico e cellulare rilevante. I modelli cellulari bidimensionali aderenti (2D) o rosette neurali contengono NSPC simili a quelli osservati nella corteccia cerebrale in via di sviluppo, che si organizzano in strutture a forma di rosetta che mostrano una corretta polarità apicobasale20,21,22. Inoltre, il sistema di coltura tridimensionale (3D) consente la generazione di organoidi del proencefalo dorsale che ricapitolano molte caratteristiche dello sviluppo corticale cerebrale umano23,24,25,26. Questi due approcci complementari di modellazione basati su cellule offrono prospettive entusiasmanti per sezionare il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo normale e patologico della corteccia cerebrale.
Qui forniamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di rosette neurali e NSPC derivati, nonché organoidi del proencefalo dorsale. Forniamo inoltre protocolli dettagliati per analizzare la biogenesi e la funzione dei PC presenti sulle NSPC testando la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog e analizzando la dinamica delle molecole cruciali coinvolte in questo percorso. Per sfruttare l’organizzazione 3D degli organoidi cerebrali, abbiamo anche impostato un metodo semplice ed economico per l’imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto che consente una rapida acquisizione, grazie ad un microscopio a foglio luminoso, dell’intero organoide, con alta risoluzione che consente di visualizzare il PC su tutti i tipi di progenitori neocorticali e neuroni dell’intero organoide. Infine, abbiamo adattato l’immunoistochimica su sezioni fluttuanti da 150 μm con successiva pulizia e acquisizione utilizzando il microscopio confocale a scansione risonante che consente l’acquisizione di immagini ad alta risoluzione, necessaria per l’analisi dettagliata della biogenesi e della funzione del PC. In particolare, il software di imaging 3D consente la ricostruzione 3D del PC con successiva analisi dei parametri morfologici tra cui lunghezza, numero e orientamento del PC, nonché la misurazione dell’intensità del segnale dei componenti ciliari lungo l’axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
I PC sono ora considerati organelli chiave che regolano i passaggi cruciali durante il normale sviluppo corticale cerebrale18,19,31 tra cui l’espansione e l’impegno NSPC8,9,10,11,12, nonché la migrazione neuronale13,14<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). LB è supportato dall’ANR nell’ambito del programma Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) e dalla Fondation Bettencourt Schueller (programma MD-PhD). L’Imagine Institute è sostenuto da finanziamenti statali dell’ANR nell’ambito del programma Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, progetti CrossLab) e come parte del secondo programma Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
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