Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller
Summary
2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.
Abstract
Primer cilia (PC), çoğu memeli hücresinin yüzeyinden çıkıntı yapan hareketli olmayan dinamik mikrotübül bazlı organellerdir. Hücre döngüsünün G1/G0 fazı sırasında eski centriole’den çıkarken, hücreler G2/M faz sınırında hücre döngüsüne yeniden girdikçe parçalara ayırırlar. Birçok hücre işlemi için çok önemli olan hücre dışı sinyalleri algılayarak ve aktararak sinyal hub’ları olarak işlev görürler. Çoğu hücre tipine benzer şekilde, tüm neokortik nöral kök ve progenitör hücreler (NSPC’ler), normal serebral kortikal gelişim için gerekli olan spesifik sinyalleri hissetmelerini ve dönüştürmelerini sağlayan bir PC barındırmaktadır. Burada, neokortik gelişim sırasında PC’nin katılımını daha fazla parçalamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hIPSC) iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) hücre tabanlı modeller oluşturmak ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Özellikle, SONIC Hedgehog (SHH) yolunun transdüksiyonu da dahil olmak üzere 2D nöral rozet türevi NSPC’lerde PC biyogenezini incelemek ve işlev görmek için protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin üç boyutlu (3D) organizasyonundan yararlanmak için , toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülemesi için basit bir yöntem tarif ediyoruz. Optik temizlemeden sonra, tüm organoidlerin hızlı bir şekilde edinimi, tüm organoidin neokortik progenitörlerinde ve nöronlarında hem centrozomların hem de PC’nin tespit edilmesine izin verir. Son olarak, 3D mekansal bilgilerin önemli bir derecesini koruyarak ve PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı nitel ve nicel analizi için gereken yüksek çözünürlüklü kazanıma izin vererek kalın serbest yüzen organoid bölümlerinin immünostaining ve temizlenmesi prosedürünü detaylandırıyoruz.
Introduction
Birincil cilia (PC), hücre dışı ortamdan çok sayıda kimyasal ve mekanik ipucunu algılayan ve transdükleyen mikrotübül bazlı organellerdir. Özellikle, PC omurgalılarda Kirpi sinyal yolunun transdüksiyonunun merkezi organeldir1,2. Çoğu sinir hücresinin uzun zamandır bir PC barındırdığı gösterilmiş olsa da, bu organel merkezi sinir sistemini şekillendirmedeki katkısı uzun zamandır değersizdir. Neokortik gelişim üzerine yapılan çalışmalar, hepsi bir PC barındıran, konumu ata kader tespiti için çok önemli olduğu öne sürülen birden fazla sinir sapı ve progenitör hücrenin (NSPC) keşfine yol açmıştır3,4,5,6,7. PC, NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 ve nöronal göçü destekleyen radyal glial iskelenin apikobasal polaritesi de dahil olmak üzere normal serebral kortikal gelişim için gerekli hücre mekanizmaları için çok önemli gösterilmiştir13. Ek olarak, internöronların kortikal plakaya teğet geçişi sırasında PC gereklidir14,15. Son olarak, serebral kortekste nöronların sinaptik bağlantılarının kurulmasında PC için bir rol önerilmiştir16,17. Tamamen, bu bulgular SEREBRAL KORİkAL Gelİşİmİn ANA ADIMLARUNDA PC’nin önemli bir rolünü savunuyor18,19 ve serebral kortikal gelişimin anomalilerinin altında kalan patolojik mekanizmalara katılımlarını araştırma ihtiyacını gündeme getirmektedir.
Son çalışmalar, insan ve hayvan modellerinde kortikal gelişim arasındaki önemli hücresel ve moleküler farklılıklar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş, insan modeli sistemleri geliştirme ihtiyacını vurgulamıştır. Bu görüşe göre, insan indüklenen pluripotent kök hücreler (hIPSC’ ler), hastalık patogenezini ilgili genetik ve hücresel bağlamda incelemek için umut verici bir yaklaşımı temsil eder. Yapışık iki boyutlu (2D) hücre bazlı modeller veya nöral rozetler, doğru apikobasal polarite gösteren rozet şeklindeki yapılara dönüşen gelişmekte olan serebral kortekste görülenlere benzer NSPC’ler içerir20,21,22. Ayrıca, üç boyutlu (3D) kültür sistemi, insan serebral kortikal gelişiminin birçok özelliğine yeniden yol açan dorsal forebrain organoidlerinin üretilmesine izin verir23,24,25,26. Bu iki tamamlayıcı hücre tabanlı modelleme yaklaşımı, serebral korteksin normal ve patolojik gelişimi sırasında PC’nin katılımını parçalamak için heyecan verici bakış açıları sunar.
Burada, nöral rozetlerin ve türetilmiş NSPC’lerin yanı sıra dorsal forebrain organoidlerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ayrıca, Sonic Hedgehog yolunun transdüksiyonunu test ederek ve bu yolda yer alan önemli moleküllerin dinamiklerini analiz ederek NSPC’lerde bulunan PC’nin biyogenezini ve işlevini analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin 3D organizasyonundan yararlanmak için, tüm organoidin ışık tabakası mikroskobu sayesinde hızlı bir şekilde edinilmesine izin veren toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülenmesi için basit ve uygun maliyetli bir yöntem belirledik ve tüm organoidin her türlü neokortik progenitör ve nöronlarında PC’yi görselleştirmeyi sağlayan yüksek çözünürlükte. Son olarak, 150 μm serbest yüzen bölümlere immünhistokimyayı, PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı analizi için gerekli olan yüksek çözünürlüklü görüntü alımına izin veren rezonans tarama konfokal mikroskobu kullanarak daha sonra temizleme ve edinme ile uyarladık. Özellikle, 3D görüntüleme yazılımı, PC’nin uzunluğu, sayısı ve yönü dahil olmak üzere morfolojik parametrelerin sonraki analizi ve akonem boyunca silier bileşenlerin sinyal yoğunluğu ölçümü ile PC’nin 3D rekonstrüksiyonuna izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PC artık normal serebral kortikal gelişim sırasında önemli adımları düzenleyen önemli organeller olarak kabul edilmektedir18,19,31 NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 yanı sıra nöronal göç13,14<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche’den (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ve N.B.B.’ye (ANR-16-CE16-0011 ve ANR-19-CE16-0002-01) verilen hibelerle desteklendi. LB, Investissements d’avenir programı (ANR-10-IAHU-01) ve Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD programı) altında ANR tarafından desteklenmektedir. Imagine Enstitüsü, Investissements d’avenir programı (ANR-10-IAHU-01, CrossLab projeleri) ve ikinci Investissements d’Avenir programının (ANR-17-RHUS-0002) bir parçası olarak ANR’den devlet finansmanı ile desteklenmektedir.
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
