Modèles 2D et 3D à base de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour disséquer l’implication du cilium primaire au cours du développement néocortical
Summary
Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).
Abstract
Les cils primaires (PC) sont des organites dynamiques non mobiles à base de microtubules qui dépassent de la surface de la plupart des cellules de mammifères. Ils émergent du centriole plus ancien pendant la phase G1/G0 du cycle cellulaire, tandis qu’ils se désassemblent lorsque les cellules rentrent dans le cycle cellulaire à la limite de phase G2/M. Ils fonctionnent comme des hubs de signaux, en détectant et en transduisant des signaux extracellulaires cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Comme pour la plupart des types de cellules, il a été démontré que toutes les cellules souches et progénitrices neurales néocorticales (NSPC) hébergent un PC leur permettant de détecter et de transduire des signaux spécifiques nécessaires au développement cortical cérébral normal. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer et caractériser des modèles cellulaires bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) afin de disséquer davantage l’implication du PC au cours du développement néocortical. En particulier, nous présentons des protocoles pour étudier la biogenèse et la fonction du PC dans les NSPC dérivés de rosettes neurales 2D, y compris la transduction de la voie Sonic Hedgehog (SHH). Pour tirer parti de l’organisation tridimensionnelle (3D) des organoïdes cérébraux, nous décrivons une méthode simple d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés. Après nettoyage optique, l’acquisition rapide d’organoïdes entiers permet la détection des centrosomes et du PC sur les progéniteurs néocorticaux et les neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous détaillons la procédure d’immunocoloration et de nettoyage des sections organoïdes épaisses flottantes en préservant un degré significatif d’informations spatiales 3D et en permettant l’acquisition à haute résolution nécessaire à l’analyse qualitative et quantitative détaillée de la biogenèse et de la fonction des PC.
Introduction
Les cils primaires (PC) sont des organites à base de microtubules qui détectent et transduisent une pléthore de signaux chimiques et mécaniques de l’environnement extracellulaire. En particulier, le PC est l’organite central pour la transduction de la voie de signalisation du hérisson chez les vertébrés1,2. Alors que la plupart des cellules neurales ont longtemps été montrées abritant un PC, la contribution de cet organite dans la formation du système nerveux central a longtemps été sous-évaluée. Des études sur le développement néocortical ont conduit à la découverte de multiples cellules souches neurales et progénitrices (NSPC), toutes abritant un PC, dont l’emplacement a été proposé comme crucial pour la détermination du devenir du progéniteur3,4,5,6,7. La PC s’est avérée cruciale pour les mécanismes cellulaires nécessaires au développement cortical cérébral normal, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la polarité apicobasale de l’échafaudage glial radial soutenant la migration neuronale13. De plus, les PC sont nécessaires lors de la migration tangentielle des interneurones vers la plaque corticale14,15. Enfin, un rôle pour le PC a été proposé dans l’établissement des connexions synaptiques des neurones dans le cortex cérébral16,17. Dans l’ensemble, ces résultats plaident en faveur d’un rôle crucial de la PC aux étapes majeures du développement cortical cérébral18,19 et soulèvent la nécessité d’étudier leur implication dans les mécanismes pathologiques sous-jacents aux anomalies du développement cortical cérébral.
Des études récentes ont largement amélioré notre compréhension des différences cellulaires et moléculaires importantes entre le développement cortical dans les modèles humains et animaux, soulignant la nécessité de développer des systèmes modèles humains. De ce point de vue, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSEh) représentent une approche prometteuse pour étudier la pathogenèse de la maladie dans un contexte génétique et cellulaire pertinent. Les modèles cellulaires bidimensionnels adhérents (2D) ou les rosettes neurales contiennent des NSPC similaires à ceux observés dans le cortex cérébral en développement, qui s’organisent en structures en forme de rosette montrant une polarité apicobasale correcte20,21,22. De plus, le système de culture tridimensionnelle (3D) permet la génération d’organoïdes dorsaux du cerveau antérieur qui récapitulent de nombreuses caractéristiques du développement cortical cérébral humain23,24,25,26. Ces deux approches complémentaires de modélisation cellulaire offrent des perspectives passionnantes pour disséquer l’implication du PC au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.
Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de rosettes neurales et de NSPC dérivés ainsi que d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. Nous fournissons également des protocoles détaillés pour analyser la biogenèse et la fonction du PC présent sur les NSPC en testant la transduction de la voie Sonic Hedgehog et en analysant la dynamique des molécules cruciales impliquées dans cette voie. Pour tirer parti de l’organisation 3D des organoïdes cérébraux, nous avons également mis en place une méthode simple et économique d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés permettant l’acquisition rapide, grâce à un microscope à feuille de lumière, de l’organoïde entier, avec une haute résolution permettant de visualiser pc sur tous les types de progéniteurs néocorticaux et de neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous avons adapté l’immunohistochimie sur des sections flottantes de 150 μm avec un nettoyage et une acquisition ultérieurs à l’aide d’un microscope confocal à balayage résonant permettant l’acquisition d’images à haute résolution, ce qui est nécessaire pour l’analyse détaillée de la biogenèse et de la fonction du PC. Plus précisément, le logiciel d’imagerie 3D permet la reconstruction 3D du PC avec une analyse ultérieure des paramètres morphologiques, y compris la longueur, le nombre et l’orientation du PC, ainsi que la mesure de l’intensité du signal des composants ciliaires le long de l’axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les PC sont maintenant considérés comme des organites clés régulant les étapes cruciales du développement cortical cérébral normal18,19,31, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la migration neuronale13,14<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) à S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) et N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 et ANR-19-CE16-0002-01). LB est soutenu par l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) et la Fondation Bettencourt Schueller (programme MD-PhD). L’Institut Imagine est soutenu par un financement public de l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, projets CrossLab) et dans le cadre du deuxième programme Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
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