שימוש בציפוי בסיס ובמיניסקופ מעוגן מראש עם עדשה אובייקטיבית למחקר חולף בסידן בעכברים

כתבי פעילות פלואורסצנטית אידיאליים להדמיה של הפעילות העצבית מכיוון שהם רגישים ויש להם טווחים דינמיים גדולים ^1,2,3. לכן, מספר גדל והולך של ניסויים משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות ישירות בפעילות העצבית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממוזער הראשון של פוטון אחד (מיניסקופ) תוכנן בשנת 2011 על ידי מארק שניצר ואחרים^. מיניסקופ זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה הפלואורסצנטית של תאי המוח הקטן בבעלי חיים המתנהגים בחופשיות⁵ (כלומר, ללא כל ריסון פיזי, ריסון ראש, הרגעה או הרדמה לבעלי החיים). נכון לעכשיו, ניתן ליישם את הטכניקה כדי לפקח על אזורי מוח שטחיים כגון קליפת המוח 6,8,15,16; אזורים תת-קורטיקליים כגון ההיפוקמפוס הגבי 8,11,13,14 וסטריאטום ^6,17; ואזורי מוח עמוקים כגון היפוקמפוס הגחון 14, אמיגדלה 10,18 וההיפותלמוס ^8,12.

בשנים האחרונות פותחו מספר מיניסקופים בקוד פתוח^{4,5,6,7,11,13,17,19}. החוקרים יכולים להרכיב את המינסקופ מבחינה כלכלית אם הם פועלים לפי ההנחיות שלב אחר שלב שסופקו על ידי צוות המיניסקופ של אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג’לס (UCLA)^4,7,11,13. מכיוון שניטור אופטי של פעילות עצבית מוגבל על ידי מגבלות העברת האור⁷ אל האוכלוסייה העצבית המעניינת וממנה, תוכנן מיניסקופ הדורש עיגון מראש של עדשת אינדקס שבירה הדרגתי אובייקטיבי (GRIN) (או עדשה אובייקטיבית) בתחתית המיניסקופ כדי להגדיל את שדה הראייה המועבר מעדשת GRIN ממסר (או עדשת ממסר)^{6,7,8,10,16,17}. עדשת ממסר זו מושתלת באזור מוח המטרה כך שהפעילות הפלואורסצנטית של אזור מוח המטרה מועברת על פני השטח של עדשת הממסר^{6,7,8,10,16,17}. בערך 1/4 מתקופה סינוסואידלית מלאה של אור עוברת דרך עדשת GRIN אובייקטיבית (~ 0.25 גובה) (איור 1A1), והתוצאה היא תמונה פלואורסצנטית מוגדלת^6,7. עדשת האובייקט לא תמיד קבועה בתחתית המיניסקופ וגם אין צורך בהשתלת עדשת הממסר^6,7,11,13,15. באופן ספציפי, ישנן שתי תצורות: אחת עם עדשה אובייקטיבית קבועה במיניסקופ ועדשת ממסר המושתלת במוח^{8,10,12,14,16} (איור 1B1) ועוד אחת עם עדשה אובייקטיבית נשלפת בלבד^6,7,11,13,15 (איור 1B2). בתכנון המבוסס על המטרה הקבועה ושילוב עדשת הממסר המושתלת, אותות הפלואורסצנטיות מהמוח מובאים לפני השטח העליונים של עדשת הממסר (איור 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. לאחר מכן, עדשת האובייקט יכולה להגדיל ולשדר את שדה הראייה מהמשטח העליון של עדשת הממסר (איור 1A2). מצד שני, עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת גמיש יותר, מה שאומר שהשתלה מוקדמת של עדשת ממסר למוח אינה חובה (איור 1B2)^6,7,11,13,15. בעת שימוש במיניסקופ המבוסס על עיצוב עדשה אובייקטיבית נשלפת, החוקרים עדיין צריכים להשתיל עדשה באזור מוח המטרה, אך הם יכולים להשתיל עדשה אובייקטיבית^6,7,11,13,15 או עדשת ממסר במוח^6,7. הבחירה של עדשת מטרה או עדשת ממסר להשתלה קובעת את תצורת המיניסקופ שבה על החוקר להשתמש. לדוגמה, V3 UCLA Miniscope מבוסס על עיצוב עדשת GRIN אובייקטיבית נשלפת. חוקרים יכולים לבחור אם להשתיל ישירות עדשה אובייקטיבית באזור המעניין במוח ולהרכיב את המיניסקופ “הריק” על עדשת האובייקט^6,7,11,13,15 (מערכת עדשה אחת; איור 1B2) או להשתיל עדשת ממסר במוח ולהרכיב מיניסקופ המעוגן מראש בעדשה אובייקטיבית^6,7 (מערכת שתי עדשות; איור 1B1). לאחר מכן המיניסקופ פועל כמצלמת פלואורסצנטיות כדי ללכוד תמונות בשידור חי של פלואורסצנטיות עצבית המיוצרת על ידי מחוון סידן מקודד גנטית^1,2,3. לאחר חיבור המיניסקופ למחשב, ניתן להעביר תמונות פלואורסצנטיות אלה למחשב ולשמור אותן כקטעי וידאו. חוקרים יכולים לחקור את הפעילות העצבית על ידי ניתוח השינויים היחסיים בפלואורסצנטיות עם כמה חבילות ניתוח^20,21 או לכתוב את הקודים שלהם לניתוח עתידי.

V3 UCLA Miniscope מספק למשתמשים גמישות להחליט אם לצלם פעילות עצבית^{עם מערכת} עדשה אחת או שתיים 7. בחירת מערכת ההקלטה מבוססת על עומק וגודל אזור המטרה במוח. בקצרה, מערכת עדשה אחת יכולה לצלם רק שטח שטחי (פחות מ-2.5 מ”מ עומק) וגדול יחסית (גדול מכ-1.8 x 1.8 מ”מ²) מכיוון שהיצרנים מייצרים רק גודל מסוים של עדשה אובייקטיבית. לעומת זאת, מערכת של שתי עדשות יכולה להיות מיושמת על כל אזור במוח המטרה. עם זאת, צמנט השיניים להדבקת לוח הבסיס נוטה לגרום לחוסר התאמה עם מרחק משתנה בין עדשת המטרה לעדשת הממסר, וכתוצאה מכך איכות התמונה ירודה. אם משתמשים במערכת של שתי עדשות, יש למקד במדויק שני מרחקי עבודה כדי להשיג את איכות ההדמיה האופטימלית (איור 1A). שני מרחקי העבודה הקריטיים האלה הם בין תאי העצב והמשטח התחתון של עדשת הממסר, ובין המשטח העליון של עדשת הממסר לבין המשטח התחתון של עדשת המטרה (איור 1A1). כל אי-התאמה או מיקום שגוי של העדשה מחוץ למרחק העבודה גורמים לכשל בהדמיה (איור 1C2). לעומת זאת, מערכת עדשה אחת דורשת מרחק עבודה מדויק אחד בלבד. עם זאת, גודל העדשה האובייקטיבית מגביל את היישום שלה לניטור אזורי מוח עמוקים (עדשת האובייקט המתאימה למיניסקופ היא בערך 1.8 ~ 2.0 מ“מ 6,11,13,15). לכן, השתלת עדשה אובייקטיבית מוגבלת לתצפית על פני השטח ואזורי מוח גדולים יחסית, כגון קליפת המוח 6,15 ו dorsal cornu ammonis 1 (CA1) בעכברים^11,13 . בנוסף, יש לשאוף שטח גדול של קליפת המוח כדי לכוון ל-CA1^11,13 הגבי. בגלל המגבלה של תצורת עדשה אחת המונעת הדמיה של אזורי מוח עמוקים, מערכות מיניסקופ מסחריות מציעות רק עיצוב משולב של עדשה אובייקטיבית/עדשת ממסר (שתי עדשות). מצד שני, ניתן לשנות את המיניסקופ V3 UCLA למערכת עדשה אחת או שתי עדשות מכיוון שהעדשה האובייקטיבית שלו ניתנת להסרה 6,11,13,15. במילים אחרות, משתמשי V3 UCLA miniscope יכולים לנצל את העדשה הנשלפת על ידי השתלתה במוח (יצירת מערכת עדשה אחת), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח שטחיות (פחות מ -2.5 מ”מ עומק), או על ידי עיגון מראש שלה במיניסקופ והשתלת עדשת ממסר במוח (יצירת מערכת שתי עדשות), בעת ביצוע ניסויים הכוללים תצפיות מוח עמוקות. ניתן ליישם את מערכת שתי העדשות גם לצורך התבוננות שטחית במוח, אך על החוקר לדעת את מרחקי העבודה המדויקים בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר. היתרון העיקרי של מערכת עם עדשה אחת הוא שיש סיכוי נמוך יותר לפספס את מרחקי העבודה מאשר במערכת עם שתי עדשות, בהתחשב בכך שיש שני מרחקי עבודה שצריך לכוון אליהם במדויק כדי להשיג איכות הדמיה אופטימלית במערכת של שתי עדשות (איור 1A). לכן, אנו ממליצים להשתמש במערכת עדשה אחת לתצפיות מוח שטחיות. עם זאת, אם הניסוי דורש הדמיה באזור המוח העמוק, על החוקר ללמוד להימנע מחוסר התאמה של שתי העדשות.

הפרוטוקול הבסיסי לתצורת שתי עדשות של מיניסקופים לניסויים כולל השתלת עדשה וציפוי בסיס 8,10,16,17. ציפוי בסיס הוא הדבקה של לוחית בסיס על ראשה של חיה כך שהמיניסקופ יכול בסופו של דבר להיות מותקן על גבי החיה ולצלם בווידיאו את אותות הפלואורסצנטיות של תאי עצב (איור 1B). הליך זה כולל שימוש במלט דנטלי כדי להדביק את לוחית הבסיס על הגולגולת (איור 1C), אולם התכווצות של מלט דנטלי יכולה לגרום לשינויים בלתי מתקבלים על הדעת במרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט ^8,17. אם המרחק המוסט בין שתי העדשות גדול מדי, לא ניתן להביא תאים למיקוד.

פרוטוקולים מפורטים לניסויי דימות סידן בעומק המוח באמצעות מיניסקופים כבר פורסמו^8,10,16,17. מחברי פרוטוקולים אלה השתמשו במערכת Inscopix^8,10,16 או עיצובים מותאמים אישית אחרים¹⁷ ותיארו את ההליכים הניסיוניים לברירה ויראלית, ניתוח וחיבור לוחית בסיס. עם זאת, לא ניתן ליישם את הפרוטוקולים שלהם במדויק על מערכות קוד פתוח אחרות, כגון מערכת V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶ופינצ’סקופ.,¹⁹. חוסר התאמה של שתי העדשות יכול להתרחש במהלך ההקלטה בתצורה של שתי עדשות עם UCLA Miniscope עקב סוג של מלט דנטלי המשמש להצמדת לוחית הבסיס לגולגולת^8,17 (איור 1C). הפרוטוקול הנוכחי נחוץ מכיוון שהמרחק בין עדשת הממסר המושתלת לעדשת האובייקט נוטה להשתנות עקב התכווצות לא רצויה של מלט דנטלי במהלך הליך ציפוי הבסיס. במהלך ציפוי הבסיס, יש למצוא את מרחק העבודה האופטימלי בין עדשת הממסר המושתלת לבין עדשת האובייקט על ידי התאמת המרחק בין המיניסקופ לחלק העליון של עדשת הממסר, ולאחר מכן יש להדביק את לוח הבסיס במיקום אידיאלי זה. לאחר קביעת המרחק הנכון בין עדשת האובייקט לעדשת הממסר המושתלת, ניתן לקבל מדידות אורך ברזולוציה תאית (איור 1B; in vivo הקלטה). מכיוון שהטווח האופטימלי של מרחקי עבודה של עדשת ממסר הוא קטן (50 – 350 מיקרומטר)^4,8התכווצות צמנט מוגזמת במהלך הריפוי עלולה להקשות על שמירת עדשת האובייקט ועדשת הממסר המושתלת בטווח המתאים., מטרת העל של דו”ח זה היא לספק פרוטוקול לצמצום בעיות ההתכווצות^8,17 המתרחשים במהלך הליך ציפוי הבסיס וכדי להגדיל את שיעור ההצלחה של הקלטות מיניסקופ של אותות פלואורסצנטיים בתצורה של שתי עדשות. הקלטה מוצלחת של מיניסקופ מוגדרת כהקלטה של שידור חי של שינויים יחסיים ניכרים בפלואורסצנטיות של נוירונים בודדים בחיה המתנהגת בחופשיות. למרות שלמותגים שונים של מלט דנטלי יש שיעורי התכווצות שונים, חוקרים יכולים לבחור מותג שנבדק בעבר^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. עם זאת, לא כל מותג קל להשגה במדינות / אזורים מסוימים בשל תקנות היבוא של חומרים רפואיים. לכן, פיתחנו שיטות לבדוק את שיעורי ההתכווצות של צמנטים דנטליים זמינים, וחשוב לספק פרוטוקול חלופי הממזער את בעיית ההתכווצות. היתרון על פני פרוטוקול ציפוי הבסיס הנוכחי הוא עלייה בשיעור ההצלחה של הדמיית סידן עם כלים וצמנט שניתן להשיג בקלות במעבדות. המינסקופ של UCLA משמש כדוגמה, אך הפרוטוקול חל גם על מיניסקופים אחרים. בדוח זה, אנו מתארים הליך ממוטב של ציפוי בסיס וגם ממליצים על כמה אסטרטגיות להתאמת מערכת שתי עדשות המיניסקופ של UCLA (איור 2A). שתי דוגמאות להשתלה מוצלחת (n = 3 עכברים) ודוגמאות להשתלה כושלת (n = 2 עכברים) עבור תצורת שתי עדשות עם המיניסקופ של UCLA מוצגות יחד עם הדיונים מסיבות ההצלחות והכישלונות.