Utilizzo di baseplating e un miniscopio preancorato con una lente obiettiva per la ricerca transitoria di calcio nei topi

I reporter di attività fluorescente sono ideali per l’imaging dell’attività neuronale perché sono sensibili e hanno ampie gamme dinamiche ^1,2,3. Pertanto, un numero crescente di esperimenti utilizza la microscopia a fluorescenza per osservare direttamente l’attività neuronale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Il primo microscopio miniaturizzato a fluorescenza a un fotone (miniscopio) è stato progettato nel 2011 da Mark Schnitzer et ^al.5. Questo miniscopio consente ai ricercatori di monitorare la dinamica della fluorescenza delle cellule cerebellari negli animali che si comportano liberamente⁵ (cioè, senza alcuna restrizione fisica, contenimento della testa, sedazione o anestesia agli animali). Attualmente, la tecnica può essere applicata per monitorare aree cerebrali superficiali come la corteccia 6,8,15,16; aree sottocorticali come l’ippocampo dorsale 8,11,13,14 e lo striato ^6,17; e aree cerebrali profonde come l’ippocampo ventrale¹⁴, l’amigdala 10,18 e l’ipotalamo ^8,12.

Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi miniscope open source^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Il miniscopio può essere assemblato economicamente dai ricercatori se seguono le linee guida passo-passo fornite dal team Miniscope dell’Università della California, Los Angeles (UCLA)^4,7,11,13. Perché il monitoraggio ottico dell’attività neurale è limitato dalle limitazioni della trasmissione della luce⁷ da e verso la popolazione neuronale di interesse, è stato progettato un miniscopio che richiede una lente a gradiente di rifrazione oggettiva (GRIN) (o lente obiettivo) da preancorare nella parte inferiore del miniscopio per ingrandire il campo visivo che viene trasmesso da una lente GRIN relè (o lente relè)^{6,7,8,10,16,17}. Questa lente relè viene impiantata nella regione cerebrale bersaglio in modo tale che l’attività di fluorescenza della regione cerebrale bersaglio venga trasmessa sulla superficie della lente relè.^{6,7,8,10,16,17}. Circa 1/4 di un periodo sinusoidale completo di luce viaggia attraverso la lente GRIN dell’obiettivo (~ 0,25 passo) (Figura 1A1), ottenendo un’immagine a fluorescenza ingrandita^6,7. La lente dell’obiettivo non è sempre fissata nella parte inferiore del miniscopio né è necessario l’impianto della lente relè.^6,7,11,13,15. Nello specifico, ci sono due configurazioni: una con una lente fissa nel miniscopio e una lente relè impiantata nel cervello^{8,10,12,14,16} (Figura 1B1) e un altro con solo un obiettivo rimovibile^6,7,11,13,15 (Figura 1B2). Nella progettazione basata sull’obiettivo fisso e sulla combinazione di lenti a relè impiantate, i segnali di fluorescenza dal cervello vengono portati sulla superficie superiore della lente del relè (Figura 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Successivamente, la lente dell’obiettivo può ingrandire e trasmettere il campo visivo dalla superficie superiore della lente relè (Figura 1A2). D’altra parte, il design della lente GRIN dell’obiettivo rimovibile è più flessibile, il che significa che il preimpianto di una lente relè nel cervello non è obbligatorio (Figura 1B2)^6,7,11,13,15. Quando si utilizza un miniscopio basato su un design di obiettivo rimovibile, i ricercatori devono ancora impiantare una lente nella regione del cervello bersaglio, ma possono impiantare una lente obiettiva^6,7,11,13,15 o una lente relè nel cervello^6,7. La scelta di un obiettivo o di una lente relè per l’impianto determina la configurazione del miniscopio che il ricercatore deve utilizzare. Ad esempio, il V3 UCLA Miniscope si basa su un obiettivo GRIN rimovibile. I ricercatori possono scegliere di impiantare direttamente una lente obiettiva nella regione cerebrale di interesse e montare il miniscopio “vuoto” sulla lente dell’obiettivo^6,7,11,13,15 (un sistema a una lente; Figura 1B2) o di impiantare una lente relè nel cervello e montare un miniscopio preancorato con una lente obiettiva.^6,7 (un sistema a due lenti; Figura 1B1). Il miniscopio funziona quindi come una fotocamera a fluorescenza per catturare immagini livestream della fluorescenza neuronale prodotta da un indicatore di calcio geneticamente codificato.^1,2,3. Dopo aver collegato il miniscope a un computer, queste immagini a fluorescenza possono essere trasferite al computer e salvate come clip video. I ricercatori possono studiare l’attività neuronale analizzando i cambiamenti relativi nella fluorescenza con alcuni pacchetti di analisi^20,21 o scrivere i loro codici per analisi future.

Il miniscopio V3 UCLA offre agli utenti la flessibilità di determinare se visualizzare l’attività neuronale con un sistema a una o due lenti⁷. La scelta del sistema di registrazione si basa sulla profondità e sulle dimensioni dell’area cerebrale target. In breve, un sistema a una lente può solo visualizzare un’area superficiale (meno di circa 2,5 mm di profondità) e relativamente grande (più grande di circa 1,8 x 1,8 mm²) perché i produttori producono solo una certa dimensione di obiettivo obiettivo. Al contrario, un sistema a due lenti può essere applicato a qualsiasi area cerebrale target. Tuttavia, il cemento dentale per l’incollaggio della piastra di base tende a causare disallineamento con una distanza alterata tra l’obiettivo e le lenti del relè, con conseguente scarsa qualità dell’immagine. Se si utilizza il sistema a due lenti, è necessario puntare con precisione due distanze di lavoro per ottenere la qualità di imaging ottimale (Figura 1A). Queste due distanze di lavoro critiche sono tra i neuroni e la superficie inferiore della lente del relè e tra la superficie superiore della lente del relè e la superficie inferiore della lente dell’obiettivo (Figura 1A1). Qualsiasi disallineamento o posizionamento errato dell’obiettivo al di fuori della distanza di lavoro provoca un errore di imaging (Figura 1C2). Al contrario, il sistema a una lente richiede solo una distanza di lavoro precisa. Tuttavia, la dimensione della lente dell’obiettivo limita la sua applicazione per il monitoraggio delle regioni cerebrali profonde (la lente dell’obiettivo che si adatta al miniscopio è di circa 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Pertanto, l’impianto di una lente obiettiva è limitato per l’osservazione della superficie e di regioni cerebrali relativamente grandi, come la corteccia 6,15 e la cornu ammonis dorsale 1 (CA1) nei topi^11,13 . Inoltre, una vasta area della corteccia deve essere aspirata per colpire il CA1 dorsale^11,13. A causa della limitazione della configurazione a una lente che impedisce l’imaging delle regioni cerebrali profonde, i sistemi miniscope commerciali offrono solo un design combinato obiettivo / obiettivo relè (due lenti). D’altra parte, il miniscopio V3 UCLA può essere modificato in un sistema a una o due lenti perché il suo obiettivo è rimovibile 6,11,13,15. In altre parole, gli utenti del miniscopio V3 UCLA possono sfruttare la lente rimovibile impiantandola nel cervello (creando un sistema a una lente), quando eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali superficiali (meno di 2,5 mm di profondità), o preancorandola nel miniscopio e impiantando una lente relè nel cervello (creando un sistema a due lenti), quando si eseguono esperimenti che coinvolgono osservazioni cerebrali profonde. Il sistema a due lenti può anche essere applicato per osservare superficialmente il cervello, ma il ricercatore deve conoscere le distanze di lavoro accurate tra la lente dell’obiettivo e la lente relè. Il vantaggio principale del sistema a una lente è che c’è una minore possibilità di perdere le distanze di lavoro rispetto a un sistema a due lenti, dato che ci sono due distanze di lavoro che devono essere mirate con precisione per ottenere una qualità di imaging ottimale nel sistema a due lenti (Figura 1A). Pertanto, si consiglia di utilizzare un sistema a una lente per le osservazioni cerebrali superficiali. Tuttavia, se l’esperimento richiede l’imaging nell’area profonda del cervello, il ricercatore deve imparare a evitare il disallineamento delle due lenti.

Il protocollo di base per la configurazione a due lenti di miniscopi per esperimenti include l’impianto di lenti e la placcatura di base 8,10,16,17. Il baseplating è l’incollaggio di una piastra di base sulla testa di un animale in modo che il miniscopio possa essere eventualmente montato sopra l’animale e videoregistrare i segnali di fluorescenza dei neuroni (Figura 1B). Questa procedura prevede l’uso di cemento dentale per incollare la piastra di base sul cranio (Figura 1C), ma il restringimento del cemento dentale può causare cambiamenti inaccettabili nella distanza tra la lente relè impiantata e la lente obiettiva ^8,17. Se la distanza spostata tra le due lenti è troppo grande, le celle non possono essere messe a fuoco.

Sono già stati pubblicati protocolli dettagliati per esperimenti di imaging del calcio cerebrale profondo che utilizzano miniscopi^8,10,16,17. Gli autori di questi protocolli hanno utilizzato il sistema Inscopix^8,10,16 o altri disegni personalizzati¹⁷ e hanno descritto le procedure sperimentali per la selezione virale, la chirurgia e l’attaccamento della piastra di base. Tuttavia, i loro protocolli non possono essere applicati con precisione ad altri sistemi open source, come il sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶e Finchscope¹⁹. Il disallineamento delle due lenti può verificarsi durante la registrazione in una configurazione a due lenti con un miniscopio UCLA a causa del tipo di cemento dentale che viene utilizzato per cementare la piastra di base al cranio^8,17 (Figura 1C). Il presente protocollo è necessario perché la distanza tra la lente relè impiantata e la lente dell’obiettivo è soggetta a spostarsi a causa del restringimento indesiderato del cemento dentale durante la procedura di placcatura di base. Durante la placcatura di base, la distanza di lavoro ottimale tra la lente relè impiantata e la lente dell’obiettivo deve essere trovata regolando la distanza tra il miniscopio e la parte superiore della lente relè e la piastra di base deve quindi essere incollata in questa posizione ideale. Dopo aver impostato la distanza corretta tra la lente dell’obiettivo e la lente relè impiantata, è possibile ottenere misurazioni longitudinali alla risoluzione cellulare (Figura 1B; in vivo registrazione). Poiché la gamma ottimale di distanze di lavoro di una lente relè è piccola (50 – 350 μm)^4,8, un eccessivo restringimento del cemento durante l’indurimento può rendere difficile mantenere la lente dell’obiettivo e la lente relè impiantata entro l’intervallo appropriato. L’obiettivo generale di questo rapporto è fornire un protocollo per ridurre i problemi di restringimento^8,17 che si verificano durante la procedura di baseplating e per aumentare il tasso di successo delle registrazioni miniscope di segnali di fluorescenza in una configurazione a due lenti. La registrazione di successo del miniscopio è definita come la registrazione di un livestream di notevoli cambiamenti relativi nella fluorescenza dei singoli neuroni in un animale che si comporta liberamente. Sebbene diverse marche di cemento dentale abbiano tassi di restringimento diversi, i ricercatori possono selezionare un marchio che è stato precedentemente testato.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Tuttavia, non tutte le marche sono facili da ottenere in alcuni paesi/regioni a causa delle normative sull’importazione di materiali medici. Pertanto, abbiamo sviluppato metodi per testare i tassi di ritiro dei cementi dentali disponibili e, soprattutto, fornire un protocollo alternativo che minimizzi il problema del restringimento. Il vantaggio rispetto all’attuale protocollo di baseplating è un aumento del tasso di successo dell’imaging del calcio con strumenti e cemento che possono essere facilmente ottenuti in laboratorio. Il miniscope UCLA è usato come esempio, ma il protocollo è applicabile anche ad altri miniscope. In questo rapporto, descriviamo una procedura di baseplating ottimizzata e raccomandiamo anche alcune strategie per il montaggio del sistema a due lenti del miniscopio UCLA (Figura 2A). Vengono presentati sia esempi di impianto riuscito (n = 3 topi) che esempi di impianto fallito (n = 2 topi) per la configurazione a due lenti con il miniscopio UCLA insieme alle discussioni per le ragioni dei successi e dei fallimenti.