Использование базового покрытия и минископа Preanchored с объективом для исследования переходных процессов кальция на мышах

Флуоресцентные репортеры активности идеально подходят для визуализации активности нейронов, поскольку они чувствительны и имеют большие динамические диапазоны ^1,2,3. Поэтому все большее число экспериментов используют флуоресцентную микроскопию для непосредственного наблюдения активности нейронов 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. Первый миниатюрный однофотонный флуоресцентный микроскоп (минископ) был разработан в 2011 году Марком Шнитцером и ^др.5. Этот минископ позволяет исследователям контролировать динамику флуоресценции мозжечковых клеток у свободно ведущих себя животных⁵ (т.е. без каких-либо физических ограничений, подголовника, седации или анестезии животных). В настоящее время методика может применяться для мониторинга поверхностных участков мозга, таких как кора 6,8,15,16; подкорковые области, такие как спинной гиппокамп 8,11,13,14 и полосатое тело ^6,17; и глубокие области мозга, такие как вентральный гиппокамп¹⁴, миндалина ^10,18 и гипоталамус ^8,12.

В последние годы было разработано несколько минископов с открытым исходным кодом.^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Минископ может быть экономически собран исследователями, если они следуют пошаговым рекомендациям, предоставленным командой Miniscope Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA).^4,7,11,13. Потому что оптический мониторинг нейронной активности ограничен ограничениями светопропускания⁷ Для и из интересующей нейронной популяции был разработан минископ, который требует, чтобы объектив с градиентным показателем преломления (GRIN) (или объектив) был предварительно отобран в нижней части минископа для увеличения поля зрения, которое передается из релейной линзы GRIN (или релейной линзы)^{6,7,8,10,16,17}. Эта релейная линза имплантируется в целевую область мозга таким образом, что флуоресцентная активность целевой области мозга передается на поверхность релейной линзы.^{6,7,8,10,16,17}. Приблизительно 1/4 полного синусоидального периода света проходит через объектив GRIN (~ 0,25 шага) (Рисунок 1A1), что приводит к увеличенному флуоресцентному изображению^6,7. Объектив не всегда фиксируется в нижней части минископа, и не требуется имплантация релейной линзы^6,7,11,13,15. В частности, существует две конфигурации: одна с фиксированным объективом в минископе и релейная линза, имплантированная в мозг.^{8,10,12,14,16} (Рисунок 1B1) и еще один со съемным объективом^6,7,11,13,15 (Рисунок 1B2). В конструкции, основанной на комбинации неподвижного объектива и имплантированной релейной линзы, флуоресцентные сигналы от мозга доводятся до верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Впоследствии объектив может увеличивать и передавать поле зрения с верхней поверхности релейной линзы (Рисунок 1A2). С другой стороны, конструкция съемной объектива GRIN более гибкая, что означает, что предварительная имплантация релейной линзы в мозг не является обязательной (Рисунок 1B2)^6,7,11,13,15. При использовании минископа, основанного на конструкции съемной объективной линзы, исследователям все еще необходимо имплантировать линзу в целевую область мозга, но они могут либо имплантировать объективную линзу.^6,7,11,13,15 или релейная линза в головном мозге^6,7. Выбор объектива или релейной линзы для имплантации определяет конфигурацию минископа, которую должен использовать исследователь. Например, минископ V3 UCLA основан на съемной конструкции объектива GRIN. Исследователи могут выбрать либо прямую имплантацию объектива в интересующую область мозга, либо установить «пустой» минископ на объектив.^6,7,11,13,15 (однообъективная система; Рисунок 1B2) или имплантировать релейную линзу в мозг и установить минископ, который предварительно отобран с объективом^6,7 (двухобъективная система; Рисунок 1B1). Затем минископ работает как флуоресцентная камера для захвата прямых трансляций изображений флуоресценции нейронов, создаваемой генетически закодированным индикатором кальция.^1,2,3. После подключения минископа к компьютеру эти флуоресцентные изображения могут быть переданы на компьютер и сохранены в виде видеоклипов. Исследователи могут изучать активность нейронов, анализируя относительные изменения флуоресценции с помощью некоторых пакетов анализа.^20,21 или написать свои коды для будущего анализа.

Минископ V3 UCLA обеспечивает гибкость для пользователей, чтобы определить, следует ли отображать активность нейронов с помощью системы⁷ с одной или двумя линзами. Выбор системы записи основывается на глубине и размере целевой области мозга. Короче говоря, система с одним объективом может отображать только область, которая является поверхностной (менее примерно 2,5 мм глубиной) и относительно большой (больше, чем примерно 1,8 x 1,8^мм2), потому что производители производят только определенный размер объектива. Напротив, двухлинзовая система может быть применена к любой целевой области мозга. Однако зубной цемент для склеивания опорной плиты имеет тенденцию вызывать смещение с измененным расстоянием между объективом и релейными линзами, что приводит к плохому качеству изображения. Если используется система с двумя объективами, для достижения оптимального качества изображения необходимо точно указать два рабочих расстояния (рисунок 1A). Эти два критических рабочих расстояния находятся между нейронами и нижней поверхностью релейной линзы, а также между верхней поверхностью релейной линзы и нижней поверхностью объектива (рисунок 1A1). Любое смещение или неправильное расположение объектива за пределами рабочего расстояния приводит к сбою изображения (рисунок 1C2). Напротив, система с одним объективом требует только одного точного рабочего расстояния. Однако размер объектива ограничивает его применение для мониторинга глубоких областей мозга (объектив, который подходит для минископа, составляет примерно 1,8 ~ 2,0 мм 6,11,13,15). Поэтому имплантация объектива ограничена для наблюдения за поверхностью и относительно большими областями мозга, такими как кора ^6,15 и спинной cornu ammonis 1 (CA1) у мышей^11,13. Кроме того, большая область коры должна быть аспирирована для нацеливания на спинную часть CA1^11,13. Из-за ограничения конфигурации с одной линзой, которая предотвращает визуализацию глубоких областей мозга, коммерческие системы минископов предлагают только комбинированную конструкцию объектива / релейной линзы (двухлинз). С другой стороны, минископ V3 UCLA может быть модифицирован в однообъективную или двухобъективную систему, потому что его объектив съемный 6,11,13,15. Другими словами, пользователи минископа V3 UCLA могут воспользоваться съемным хрусталиком, имплантировав его в мозг (создав систему с одной линзой), при выполнении экспериментов с участием поверхностных наблюдений за мозгом (менее 2,5 мм в глубину) или предварительно выбрав его в минископ и имплантировав релейную линзу в мозг (создав двухлинзовую систему), при выполнении экспериментов с участием глубоких наблюдений мозга. Система с двумя линзами также может быть применена для поверхностного наблюдения за мозгом, но исследователь должен знать точные рабочие расстояния между объективом и линзой реле. Основным преимуществом системы с одним объективом является то, что существует меньшая вероятность пропуска рабочих расстояний, чем в системе с двумя объективами, учитывая, что существует два рабочих расстояния, которые должны быть точно нацелены для достижения оптимального качества изображения в системе с двумя объективами (рисунок 1A). Поэтому мы рекомендуем использовать однолинзовую систему для поверхностных наблюдений за мозгом. Однако, если эксперимент требует визуализации в глубокой области мозга, исследователь должен научиться избегать смещения двух линз.

Базовый протокол двухлинзовой конфигурации минископов для экспериментов включает имплантацию линз и покрытие^{оснований} 8,10,16,17. Опорное покрытие – это наклеивание опорной пластины на голову животного, так что минископ может быть в конечном итоге установлен поверх животного и видеозапись флуоресцентных сигналов нейронов (рисунок 1B). Эта процедура включает в себя использование зубного цемента для приклеивания опорной пластины на череп (рисунок 1C), но усадка зубного цемента может вызвать неприемлемые изменения расстояния между имплантированной релейной линзой и объективом ^8,17. Если смещенное расстояние между двумя линзами слишком велико, клетки не могут быть сфокусированы.

Подробные протоколы экспериментов по глубокой визуализации кальция мозга с использованием минископов уже опубликованы^8,10,16,17. Авторы этих протоколов использовали систему Inscopix^8,10,16 или другие индивидуальные проекты¹⁷ и описали экспериментальные процедуры вирусного отбора, хирургии и прикрепления опорной пластины. Однако их протоколы не могут быть точно применены к другим системам с открытым исходным кодом, таким как система V3 UCLA Miniscope, NINscope.⁶и финчскоп¹⁹. Смещение двух линз может произойти во время записи в конфигурации с двумя линзами с минископом UCLA из-за типа зубного цемента, который используется для цементирования опорной пластины к черепу^8,17 (Рисунок 1C). Настоящий протокол необходим, поскольку расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом склонно к смещению из-за нежелательной усадки зубного цемента во время процедуры нанесения опорного покрытия. Во время нанесения опорного покрытия оптимальное рабочее расстояние между имплантированной релейной линзой и объективом должно быть найдено путем регулировки расстояния между минископом и верхней частью релейной линзы, а затем опорная пластина должна быть приклеена в этом идеальном месте. После установки правильного расстояния между объективом и имплантированной релейной линзой можно получить продольные измерения с клеточным разрешением (Рисунок 1B; in vivo запись). Так как оптимальный диапазон рабочих расстояний релейной линзы невелик (50 – 350 мкм)^4,8, чрезмерная усадка цемента во время отверждения может затруднить удержание объектива и имплантированной релейной линзы в соответствующем диапазоне. Общая цель этого отчета состоит в том, чтобы предоставить протокол для уменьшения проблем усадки^8,17 которые происходят во время процедуры опорного покрытия и для увеличения успешности минископических записей флуоресцентных сигналов в конфигурации с двумя линзами. Успешная запись минископа определяется как запись прямой трансляции заметных относительных изменений флуоресценции отдельных нейронов у свободно ведущего себя животного. Хотя разные марки стоматологического цемента имеют разную скорость усадки, исследователи могут выбрать бренд, который был ранее протестирован.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Тем не менее, не каждый бренд легко получить в некоторых странах / регионах из-за правил импорта медицинских материалов. Поэтому мы разработали методы для проверки скорости усадки доступных зубных цементов и, что важно, предоставляем альтернативный протокол, который минимизирует проблему усадки. Преимуществом по сравнению с настоящим протоколом нанесения фундамента является увеличение успешности визуализации кальция с помощью инструментов и цемента, которые можно легко получить в лабораториях. В качестве примера используется минископ UCLA, но протокол также применим к другим минископам. В этом отчете мы описываем оптимизированную процедуру нанесения опорных покрытий, а также рекомендуем некоторые стратегии установки системы минископа UCLA с двумя линзами (Рисунок 2А). Представлены как примеры успешной имплантации (n= 3 мыши), так и примеры неудачной имплантации (n=2 мыши) для двухлинзовой конфигурации с минископом UCLA вместе с обсуждениями причин успехов и неудач.