Usando Baseplating e um Miniscópio Pré-ancorado com uma Lente Objetiva para Pesquisa Transiente de Cálcio em Camundongos

Os repórteres de atividade fluorescente são ideais para a imagem da atividade neuronal, pois são sensíveis e apresentam grandes amplitudes dinâmicas ^1,2,3. Portanto, um número crescente de experimentos está utilizando microscopia de fluorescência para observar diretamente a atividade neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. O primeiro microscópio miniaturizado de fluorescência de um fóton (miniscópio) foi projetado em 2011 por Mark Schnitzer et ^al.5. Esse miniscópio permite que os pesquisadores monitorem a dinâmica de fluorescência das células cerebelares em animais de comportamento livre⁵ (ou seja, sem qualquer restrição física, apoio de cabeça, sedação ou anestesia para os animais). Atualmente, a técnica pode ser aplicada para monitorar áreas cerebrais superficiais, como o córtex 6,8,15,16; áreas subcorticais como o hipocampo dorsal 8,11,13,14 e o ^{estriado 6,17}; e áreas cerebrais profundas, como o hipocampo ventral¹⁴, a amígdala 10,18 e o hipotálamo ^8,12.

Nos últimos anos, vários miniscópios de código aberto foram desenvolvidos^{4,5,6,7,11,13,17,19}. O miniscópio pode ser montado economicamente por pesquisadores se eles seguirem as diretrizes passo a passo fornecidas pela equipe de miniscópio da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA)^4,7,11,13. Porque o monitoramento óptico da atividade neural é restrito pelas limitações da transmissão de luz⁷ de e para a população neuronal de interesse, um miniscópio foi projetado que requer que uma lente de índice de refração de gradiente objetivo (GRIN) objetiva (ou lente objetiva) seja pré-ancorada na parte inferior do miniscópio para ampliar o campo de visão que é retransmitido de uma lente GRIN de relé (ou lente de relé)^{6,7,8,10,16,17}. Esta lente de relé é implantada na região do cérebro alvo de tal forma que a atividade de fluorescência da região do cérebro alvo é retransmitida para a superfície da lente de relé^{6,7,8,10,16,17}. Aproximadamente 1/4 de um período sinusoidal completo de luz viaja através da lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch) (Figura 1A1), resultando em uma imagem de fluorescência ampliada^6,7. A lente objetiva nem sempre é fixada na parte inferior do miniscópio nem é necessária a implantação da lente de relé^6,7,11,13,15. Especificamente, existem duas configurações: uma com uma lente objetiva fixa no miniscópio e uma lente de relé implantada no cérebro.^{8,10,12,14,16} (Figura 1B1) e outro com apenas uma lente objetiva removível^6,7,11,13,15 (Figura 1B2). No projeto baseado na combinação de objetiva fixa e lente de relé implantada, os sinais de fluorescência do cérebro são trazidos para a superfície superior da lente de relé (Figura 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Posteriormente, a lente objetiva pode ampliar e transmitir o campo visual a partir da superfície superior da lente relé (Figura 1A2). Por outro lado, o design da lente GRIN objetiva removível é mais flexível, o que significa que a pré-implantação de uma lente de relé no cérebro não é obrigatória (Figura 1B2)^6,7,11,13,15. Ao usar um miniscópio baseado em um design de lente objetiva removível, os pesquisadores ainda precisam implantar uma lente na região do cérebro alvo, mas podem implantar uma lente objetiva.^6,7,11,13,15 ou uma lente de relé no cérebro^6,7. A escolha de uma objetiva ou de uma lente de relé para implantação determina a configuração do miniscópio que o pesquisador deve utilizar. Por exemplo, o V3 UCLA Miniscope é baseado em um design de lente GRIN de objetiva removível. Os pesquisadores podem optar por implantar diretamente uma lente objetiva na região do cérebro de interesse e montar o miniscópio “vazio” na lente objetiva.^6,7,11,13,15 (um sistema de uma lente; Figura 1B2) ou para implantar uma lente de relé no cérebro e montar um miniscópio pré-ancorado com uma lente objetiva^6,7 (um sistema de duas lentes; Figura 1B1). O miniscópio funciona então como uma câmera de fluorescência para capturar imagens de transmissão ao vivo de fluorescência neuronal produzidas por um indicador de cálcio geneticamente codificado.^1,2,3. Depois que o miniscópio é conectado a um computador, essas imagens de fluorescência podem ser transferidas para o computador e salvas como clipes de vídeo. Os pesquisadores podem estudar a atividade neuronal analisando as mudanças relativas na fluorescência com alguns pacotes de análise^20,21 ou escrever seus códigos para análise futura.

O V3 UCLA Miniscope oferece flexibilidade para os usuários determinarem se devem visualizar a atividade neuronal com um sistema de uma ou duas lentes⁷. A escolha do sistema de gravação é baseada na profundidade e no tamanho da área do cérebro alvo. Em resumo, um sistema de uma lente só pode obter imagens de uma área superficial (menos de aproximadamente 2,5 mm de profundidade) e relativamente grande (maior que aproximadamente 1,8 x 1,8 mm²) porque os fabricantes produzem apenas um certo tamanho de lente objetiva. Em contraste, um sistema de duas lentes pode ser aplicado a qualquer área do cérebro alvo. No entanto, o cimento dentário para colar a placa de base tende a causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando em uma má qualidade de imagem. Se o sistema de duas lentes estiver sendo usado, duas distâncias de trabalho precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal (Figura 1A). Essas duas distâncias críticas de trabalho estão entre os neurônios e a superfície inferior da lente de relé e entre a superfície superior da lente de relé e a superfície inferior da lente objetiva (Figura 1A1). Qualquer desalinhamento ou mau posicionamento da lente fora da distância de trabalho resulta em falha de imagem (Figura 1C2). Em contraste, o sistema de uma lente requer apenas uma distância de trabalho precisa. No entanto, o tamanho da lente objetiva limita sua aplicação para o monitoramento de regiões cerebrais profundas (a lente objetiva que se encaixa no miniscópio é de aproximadamente 1,8 ~ 2,0 mm ^6,11,13,15). Portanto, o implante de uma lente objetiva é limitado para a observação da superfície e de regiões cerebrais relativamente grandes, como o córtex^6,15 e o cornu ammonis dorsal 1 (CA1) em camundongos^11,13 . Além disso, uma grande área do córtex deve ser aspirada para atingir o CA1 dorsal^11,13. Devido à limitação da configuração de uma lente que impede a imagem de regiões profundas do cérebro, os sistemas de miniscópio comerciais oferecem apenas um design combinado de lente objetiva / lente de relé (duas lentes). Por outro lado, o miniscópio V3 UCLA pode ser modificado em um sistema de uma lente ou duas lentes, porque sua lente objetiva é removível 6,11,13,15. Em outras palavras, os usuários do miniscópio V3 UCLA podem tirar proveito da lente removível implantando-a no cérebro (criando um sistema de uma lente), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais superficiais (menos de 2,5 mm de profundidade) ou pré-ancorando-a no miniscópio e implantando uma lente de relé no cérebro (criando um sistema de duas lentes), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais profundas. O sistema de duas lentes também pode ser aplicado para observar superficialmente o cérebro, mas o pesquisador deve conhecer as distâncias de trabalho precisas entre a lente objetiva e a lente de retransmissão. A principal vantagem do sistema de uma lente é que há uma chance menor de perder as distâncias de trabalho do que com um sistema de duas lentes, uma vez que existem duas distâncias de trabalho que precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal no sistema de duas lentes (Figura 1A). Portanto, recomendamos o uso de um sistema de uma lente para observações cerebrais superficiais. No entanto, se o experimento exigir imagens na área profunda do cérebro, o pesquisador deve aprender a evitar o desalinhamento das duas lentes.

O protocolo básico para configuração de miniscópios de duas lentes para experimentos inclui o implante de lentes e o baseplating 8,10,16,17. Baseplating é a colagem de uma placa de base na cabeça de um animal para que o miniscópio possa ser eventualmente montado em cima do animal e filmar os sinais de fluorescência dos neurônios (Figura 1B). Esse procedimento envolve o uso de cimento dentário para colar a placa de base no crânio (Figura 1C), mas o encolhimento do cimento dentário pode causar alterações inaceitáveis na distância entre a lente relé implantada e a lente objetiva ^8,17. Se a distância deslocada entre as duas lentes for muito grande, as células não podem ser colocadas em foco.

Protocolos detalhados para experimentos de imagem de cálcio cerebral profundo usando miniscópios já foram publicados^8,10,16,17. Os autores desses protocolos utilizaram o sistema Inscopix^8,10,16 ou outros projetos personalizados¹⁷ e descreveram os procedimentos experimentais para seleção viral, cirurgia e fixação da placa de base. No entanto, seus protocolos não podem ser aplicados com precisão a outros sistemas de código aberto, como o sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶e Finchscope¹⁹. O desalinhamento das duas lentes pode ocorrer durante a gravação em uma configuração de duas lentes com um Miniscópio UCLA devido ao tipo de cimento dentário que é usado para cimentar a placa de base ao crânio^8,17 (Figura 1C). O presente protocolo é necessário porque a distância entre a lente de relé implantada e a lente objetiva é propensa a mudar devido ao encolhimento indesejável do cimento dentário durante o procedimento de baseplating. Durante o baseplating, a distância de trabalho ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva deve ser encontrada ajustando a distância entre o miniscópio e a parte superior da lente de relé, e a placa de base deve então ser colada neste local ideal. Após o ajuste da distância correta entre a lente objetiva e a lente relé implantada, medidas longitudinais podem ser obtidas na resolução celular (Figura 1B; in vivo gravação). Uma vez que a faixa ideal de distâncias de trabalho de uma lente de relé é pequena (50 – 350 μm)^4,8, o encolhimento excessivo do cimento durante a cura pode dificultar a manutenção da lente objetiva e da lente de relé implantada dentro da faixa apropriada. O objetivo geral deste relatório é fornecer um protocolo para reduzir os problemas de encolhimento.^8,17 que ocorrem durante o procedimento de baseplating e para aumentar a taxa de sucesso das gravações de miniscópio de sinais de fluorescência em uma configuração de duas lentes. A gravação bem-sucedida do miniscópio é definida como a gravação de uma transmissão ao vivo de mudanças relativas perceptíveis na fluorescência de neurônios individuais em um animal que se comporta livremente. Embora diferentes marcas de cimento dental tenham diferentes taxas de encolhimento, os pesquisadores podem selecionar uma marca que tenha sido testada anteriormente^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. No entanto, nem todas as marcas são fáceis de obter em alguns países / regiões devido aos regulamentos de importação de materiais médicos. Portanto, desenvolvemos métodos para testar as taxas de encolhimento dos cimentos dentários disponíveis e, o que é mais importante, fornecer um protocolo alternativo que minimize o problema de encolhimento. A vantagem sobre o atual protocolo de baseplating é um aumento na taxa de sucesso da imagem de cálcio com ferramentas e cimento que podem ser facilmente obtidos em laboratórios. O miniscópio da UCLA é usado como exemplo, mas o protocolo também é aplicável a outros miniscópios. Neste relato, descrevemos um procedimento de baseplating otimizado e também recomendamos algumas estratégias para o ajuste do sistema de duas lentes do miniscópio UCLA (Figura 2A). Ambos os exemplos de implantação bem-sucedida (n = 3 camundongos) e exemplos de implantação fracassada (n = 2 camundongos) para a configuração de duas lentes com o miniscópio UCLA são apresentados juntamente com as discussões pelas razões dos sucessos e fracassos.