Summary

Usando Baseplating e um Miniscópio Pré-ancorado com uma Lente Objetiva para Pesquisa Transiente de Cálcio em Camundongos

Published: June 05, 2021
doi:

Summary

O encolhimento do cimento dentário durante a cura desloca a placa de base. Este protocolo minimiza o problema, criando uma base inicial do cimento dentário que deixa espaço para cimentar a placa de base. Semanas depois, a placa de base pode ser cimentada em posição neste andaime usando pouco cimento novo, reduzindo assim o encolhimento.

Abstract

Os neurocientistas usam microscópios em miniatura (miniscópios) para observar a atividade neuronal em animais que se comportam livremente. A equipe do Miniscope da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA) fornece recursos abertos para que os pesquisadores construam miniscópios eles mesmos. O V3 UCLA Miniscope é um dos miniscópios de código aberto mais populares atualmente em uso. Ele permite a imagem dos transientes de fluorescência emitidos por neurônios geneticamente modificados através de uma lente objetiva implantada no córtex superficial (um sistema de uma lente), ou em áreas cerebrais profundas através de uma combinação de uma lente de relé implantada no cérebro profundo e uma lente objetiva que é pré-ancorada no miniscópio para observar a imagem retransmitida (um sistema de duas lentes). Mesmo em condições ideais (quando os neurônios expressam indicadores de fluorescência e a lente de relé foi implantada adequadamente), uma mudança de volume do cimento dentário entre a placa de base e sua fixação ao crânio após a cura do cimento pode causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando na má qualidade da imagem. Uma placa de base é uma placa que ajuda a montar o miniscópio no crânio e fixa a distância de trabalho entre as lentes objetiva e de relé. Assim, mudanças no volume do cimento dentário ao redor da placa de base alteram a distância entre as lentes. O presente protocolo tem como objetivo minimizar o problema de desalinhamento causado por alterações de volume no cimento dental. O protocolo reduz o desalinhamento construindo uma base inicial de cimento dentário durante o implante da lente de relé. O tempo de convalescença após a implantação é suficiente para a fundação do cimento dentário curar completamente a placa de base, de modo que a placa de base possa ser cimentada neste andaime usando o mínimo de cimento novo possível. No presente artigo, descrevemos estratégias de baseplating em camundongos para permitir a imagem da atividade neuronal com uma lente objetiva ancorada no miniscópio.

Introduction

Os repórteres de atividade fluorescente são ideais para a imagem da atividade neuronal, pois são sensíveis e apresentam grandes amplitudes dinâmicas 1,2,3. Portanto, um número crescente de experimentos está utilizando microscopia de fluorescência para observar diretamente a atividade neuronal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16. O primeiro microscópio miniaturizado de fluorescência de um fóton (miniscópio) foi projetado em 2011 por Mark Schnitzer et al.5. Esse miniscópio permite que os pesquisadores monitorem a dinâmica de fluorescência das células cerebelares em animais de comportamento livre5 (ou seja, sem qualquer restrição física, apoio de cabeça, sedação ou anestesia para os animais). Atualmente, a técnica pode ser aplicada para monitorar áreas cerebrais superficiais, como o córtex 6,8,15,16; áreas subcorticais como o hipocampo dorsal 8,11,13,14 e o estriado 6,17; e áreas cerebrais profundas, como o hipocampo ventral14, a amígdala 10,18 e o hipotálamo 8,12.

Nos últimos anos, vários miniscópios de código aberto foram desenvolvidos4,5,6,7,11,13,17,19. O miniscópio pode ser montado economicamente por pesquisadores se eles seguirem as diretrizes passo a passo fornecidas pela equipe de miniscópio da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA)4,7,11,13. Porque o monitoramento óptico da atividade neural é restrito pelas limitações da transmissão de luz7 de e para a população neuronal de interesse, um miniscópio foi projetado que requer que uma lente de índice de refração de gradiente objetivo (GRIN) objetiva (ou lente objetiva) seja pré-ancorada na parte inferior do miniscópio para ampliar o campo de visão que é retransmitido de uma lente GRIN de relé (ou lente de relé)6,7,8,10,16,17. Esta lente de relé é implantada na região do cérebro alvo de tal forma que a atividade de fluorescência da região do cérebro alvo é retransmitida para a superfície da lente de relé6,7,8,10,16,17. Aproximadamente 1/4 de um período sinusoidal completo de luz viaja através da lente GRIN objetiva (~ 0,25 pitch) (Figura 1A1), resultando em uma imagem de fluorescência ampliada6,7. A lente objetiva nem sempre é fixada na parte inferior do miniscópio nem é necessária a implantação da lente de relé6,7,11,13,15. Especificamente, existem duas configurações: uma com uma lente objetiva fixa no miniscópio e uma lente de relé implantada no cérebro.8,10,12,14,16 (Figura 1B1) e outro com apenas uma lente objetiva removível6,7,11,13,15 (Figura 1B2). No projeto baseado na combinação de objetiva fixa e lente de relé implantada, os sinais de fluorescência do cérebro são trazidos para a superfície superior da lente de relé (Figura 1A1)7,8,10,12,14,16. Posteriormente, a lente objetiva pode ampliar e transmitir o campo visual a partir da superfície superior da lente relé (Figura 1A2). Por outro lado, o design da lente GRIN objetiva removível é mais flexível, o que significa que a pré-implantação de uma lente de relé no cérebro não é obrigatória (Figura 1B2)6,7,11,13,15. Ao usar um miniscópio baseado em um design de lente objetiva removível, os pesquisadores ainda precisam implantar uma lente na região do cérebro alvo, mas podem implantar uma lente objetiva.6,7,11,13,15 ou uma lente de relé no cérebro6,7. A escolha de uma objetiva ou de uma lente de relé para implantação determina a configuração do miniscópio que o pesquisador deve utilizar. Por exemplo, o V3 UCLA Miniscope é baseado em um design de lente GRIN de objetiva removível. Os pesquisadores podem optar por implantar diretamente uma lente objetiva na região do cérebro de interesse e montar o miniscópio “vazio” na lente objetiva.6,7,11,13,15 (um sistema de uma lente; Figura 1B2) ou para implantar uma lente de relé no cérebro e montar um miniscópio pré-ancorado com uma lente objetiva6,7 (um sistema de duas lentes; Figura 1B1). O miniscópio funciona então como uma câmera de fluorescência para capturar imagens de transmissão ao vivo de fluorescência neuronal produzidas por um indicador de cálcio geneticamente codificado.1,2,3. Depois que o miniscópio é conectado a um computador, essas imagens de fluorescência podem ser transferidas para o computador e salvas como clipes de vídeo. Os pesquisadores podem estudar a atividade neuronal analisando as mudanças relativas na fluorescência com alguns pacotes de análise20,21 ou escrever seus códigos para análise futura.

O V3 UCLA Miniscope oferece flexibilidade para os usuários determinarem se devem visualizar a atividade neuronal com um sistema de uma ou duas lentes7. A escolha do sistema de gravação é baseada na profundidade e no tamanho da área do cérebro alvo. Em resumo, um sistema de uma lente só pode obter imagens de uma área superficial (menos de aproximadamente 2,5 mm de profundidade) e relativamente grande (maior que aproximadamente 1,8 x 1,8 mm2) porque os fabricantes produzem apenas um certo tamanho de lente objetiva. Em contraste, um sistema de duas lentes pode ser aplicado a qualquer área do cérebro alvo. No entanto, o cimento dentário para colar a placa de base tende a causar desalinhamento com uma distância alterada entre as lentes objetiva e de relé, resultando em uma má qualidade de imagem. Se o sistema de duas lentes estiver sendo usado, duas distâncias de trabalho precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal (Figura 1A). Essas duas distâncias críticas de trabalho estão entre os neurônios e a superfície inferior da lente de relé e entre a superfície superior da lente de relé e a superfície inferior da lente objetiva (Figura 1A1). Qualquer desalinhamento ou mau posicionamento da lente fora da distância de trabalho resulta em falha de imagem (Figura 1C2). Em contraste, o sistema de uma lente requer apenas uma distância de trabalho precisa. No entanto, o tamanho da lente objetiva limita sua aplicação para o monitoramento de regiões cerebrais profundas (a lente objetiva que se encaixa no miniscópio é de aproximadamente 1,8 ~ 2,0 mm 6,11,13,15). Portanto, o implante de uma lente objetiva é limitado para a observação da superfície e de regiões cerebrais relativamente grandes, como o córtex6,15 e o cornu ammonis dorsal 1 (CA1) em camundongos11,13 . Além disso, uma grande área do córtex deve ser aspirada para atingir o CA1 dorsal11,13. Devido à limitação da configuração de uma lente que impede a imagem de regiões profundas do cérebro, os sistemas de miniscópio comerciais oferecem apenas um design combinado de lente objetiva / lente de relé (duas lentes). Por outro lado, o miniscópio V3 UCLA pode ser modificado em um sistema de uma lente ou duas lentes, porque sua lente objetiva é removível 6,11,13,15. Em outras palavras, os usuários do miniscópio V3 UCLA podem tirar proveito da lente removível implantando-a no cérebro (criando um sistema de uma lente), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais superficiais (menos de 2,5 mm de profundidade) ou pré-ancorando-a no miniscópio e implantando uma lente de relé no cérebro (criando um sistema de duas lentes), ao realizar experimentos envolvendo observações cerebrais profundas. O sistema de duas lentes também pode ser aplicado para observar superficialmente o cérebro, mas o pesquisador deve conhecer as distâncias de trabalho precisas entre a lente objetiva e a lente de retransmissão. A principal vantagem do sistema de uma lente é que há uma chance menor de perder as distâncias de trabalho do que com um sistema de duas lentes, uma vez que existem duas distâncias de trabalho que precisam ser direcionadas com precisão para alcançar a qualidade de imagem ideal no sistema de duas lentes (Figura 1A). Portanto, recomendamos o uso de um sistema de uma lente para observações cerebrais superficiais. No entanto, se o experimento exigir imagens na área profunda do cérebro, o pesquisador deve aprender a evitar o desalinhamento das duas lentes.

O protocolo básico para configuração de miniscópios de duas lentes para experimentos inclui o implante de lentes e o baseplating 8,10,16,17. Baseplating é a colagem de uma placa de base na cabeça de um animal para que o miniscópio possa ser eventualmente montado em cima do animal e filmar os sinais de fluorescência dos neurônios (Figura 1B). Esse procedimento envolve o uso de cimento dentário para colar a placa de base no crânio (Figura 1C), mas o encolhimento do cimento dentário pode causar alterações inaceitáveis na distância entre a lente relé implantada e a lente objetiva 8,17. Se a distância deslocada entre as duas lentes for muito grande, as células não podem ser colocadas em foco.

Protocolos detalhados para experimentos de imagem de cálcio cerebral profundo usando miniscópios já foram publicados8,10,16,17. Os autores desses protocolos utilizaram o sistema Inscopix8,10,16 ou outros projetos personalizados17 e descreveram os procedimentos experimentais para seleção viral, cirurgia e fixação da placa de base. No entanto, seus protocolos não podem ser aplicados com precisão a outros sistemas de código aberto, como o sistema V3 UCLA Miniscope, NINscope6e Finchscope19. O desalinhamento das duas lentes pode ocorrer durante a gravação em uma configuração de duas lentes com um Miniscópio UCLA devido ao tipo de cimento dentário que é usado para cimentar a placa de base ao crânio8,17 (Figura 1C). O presente protocolo é necessário porque a distância entre a lente de relé implantada e a lente objetiva é propensa a mudar devido ao encolhimento indesejável do cimento dentário durante o procedimento de baseplating. Durante o baseplating, a distância de trabalho ideal entre a lente de relé implantada e a lente objetiva deve ser encontrada ajustando a distância entre o miniscópio e a parte superior da lente de relé, e a placa de base deve então ser colada neste local ideal. Após o ajuste da distância correta entre a lente objetiva e a lente relé implantada, medidas longitudinais podem ser obtidas na resolução celular (Figura 1B; in vivo gravação). Uma vez que a faixa ideal de distâncias de trabalho de uma lente de relé é pequena (50 – 350 μm)4,8, o encolhimento excessivo do cimento durante a cura pode dificultar a manutenção da lente objetiva e da lente de relé implantada dentro da faixa apropriada. O objetivo geral deste relatório é fornecer um protocolo para reduzir os problemas de encolhimento.8,17 que ocorrem durante o procedimento de baseplating e para aumentar a taxa de sucesso das gravações de miniscópio de sinais de fluorescência em uma configuração de duas lentes. A gravação bem-sucedida do miniscópio é definida como a gravação de uma transmissão ao vivo de mudanças relativas perceptíveis na fluorescência de neurônios individuais em um animal que se comporta livremente. Embora diferentes marcas de cimento dental tenham diferentes taxas de encolhimento, os pesquisadores podem selecionar uma marca que tenha sido testada anteriormente6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. No entanto, nem todas as marcas são fáceis de obter em alguns países / regiões devido aos regulamentos de importação de materiais médicos. Portanto, desenvolvemos métodos para testar as taxas de encolhimento dos cimentos dentários disponíveis e, o que é mais importante, fornecer um protocolo alternativo que minimize o problema de encolhimento. A vantagem sobre o atual protocolo de baseplating é um aumento na taxa de sucesso da imagem de cálcio com ferramentas e cimento que podem ser facilmente obtidos em laboratórios. O miniscópio da UCLA é usado como exemplo, mas o protocolo também é aplicável a outros miniscópios. Neste relato, descrevemos um procedimento de baseplating otimizado e também recomendamos algumas estratégias para o ajuste do sistema de duas lentes do miniscópio UCLA (Figura 2A). Ambos os exemplos de implantação bem-sucedida (n = 3 camundongos) e exemplos de implantação fracassada (n = 2 camundongos) para a configuração de duas lentes com o miniscópio UCLA são apresentados juntamente com as discussões pelas razões dos sucessos e fracassos.

Protocol

Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Nacional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Taiwan (Nº de Aprovação: NTU-109-EL-00029 e NTU-108-EL-00158). 1. Avaliação da alteração volêmica do cimento dentário NOTA: Alterações no volume de cimento dental ocorrem durante o processo de cura. Testar as alterações de volume do cimento dentário antes da implantação e bas…

Representative Results

Avaliação da alteração do volume de cimento dentárioUma vez que o volume de cimento dentário muda durante o processo de cura, pode impactar significativamente a qualidade da imagem, uma vez que a distância de trabalho de uma lente GRIN é de aproximadamente 50 a 350 μm 4,8. Portanto, dois cimentos dentários comercialmente disponíveis foram testados neste caso, Tempron e Tokuso, antes do procedimento de implantação e baseplating (<…

Discussion

O presente relatório descreve um protocolo experimental detalhado para pesquisadores que usam o sistema UCLA Miniscope de duas lentes. As ferramentas projetadas em nosso protocolo são relativamente acessíveis para qualquer laboratório que deseje experimentar imagens de cálcio in vivo. Alguns protocolos, como injeção viral, implantação de lentes, baseplating fictício e baseplating, também podem ser usados para outras versões do sistema miniscópio para melhorar a taxa de sucesso da imagem de cálcio. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Materials

0.7-mm drill bit  #19008-07 Fine Science Tools; USA for surgery
0.1–10 μl pipette tips 104-Q; QSP Fisher Scientific; Singapore for testing dental cement
20 G IV cathater #SR-OX2032CA Terumo Corporation; Tokyo, Japan for surgery
27 G needle AGANI, AN*2713R Terumo Corporation; Tokyo, Japan for surgery
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE #104487-AAV9; 1.5*10^13 Addgene viral prep; MA, USA for viral injection
Atropine sulfate Astart; Hsinchu, Taiwan for surgery/dummy baseplating/baseplating
Baseplate V3 http://miniscope.org for dummy baseplating/baseplating
BLU TACK #30840350 Bostik; Chelsea, Massachusetts, USA Reusable adhesive clay; for surgery/dummy baseplating/baseplating
Bone Rongeur Friedman 13 cm Diener; Tuttlingen, Germany for baseplating
Buprenorphine INDIVIOR; UK for surgery
Carprofen Rimadyl Zoetis; Exton, PA analgesia
Ceftazidime Taiwan Biotech; Taiwan prevent infection
Data Acquisition PCB for UCLA Miniscope purchased on https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq for baseplating
Dental cement set Tempron GC Corp; Tokyo, Japan for testing dental cement
Dental cement set Tokuso Curefast Tokuyama Dental Corp.; Tokyo, Japan for testing dental cement/surgery/dummy baseplating/baseplating
Dual Lab Standard with Mouse and Rat Adaptors #51673 Stoelting Co; Illinois, USA for surgery/dummy baseplating/baseplating
Duratear ointment Alcon; Geneva, Switzerland for surgery/dummy baseplating/baseplating
Ibuprofen YungShin; Taiwan analgesia
Isoflurane Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Taiwan for surgery/dummy baseplating/baseplating
Inscopix nVista System Inscopix; Palo Alto, CA for comparison with V3 UCLA Miniscope
Ketamine Pfizer; NY, NY for euthanasia
Normal saline for surgery
Micro bulldog clamps #12.102.04 Dimedo; Tuttlingen, Germany for lens implantation
Microliter Microsyringes, 2.0 µL, 25 gauge #88400 Hamilton; Bonaduz, Switzerland for viral injection
Molding silicone rubber ZA22 Thixo Zhermack; Badia Polesine, Italy for dummy baseplating
Objective Gradient index (GRIN) lens #64519 Edmund Optics; NJ, USA for dummy baseplating/baseplating
Parafilm #PM996 Bemis; Neenah, USA for dummy baseplating
Portable Suction #DF-750 Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Taiwan for surgery
Relay GRIN lens #1050-002177 Inscopix; Palo Alto, CA, USA for dummy baseplating/baseplating
Stainless steel anchor screws 1.00 mm diameter, total length 3.00 mm for surgery
Stereo microscope #SL720 Sage Vison; New Taipei City, Taiwan for surgery/dummy baseplating/baseplating
Stereotaxic apparatus #51673 Stoelting; IL, USA for surgery/dummy baseplating/baseplating
UV Cure Adhesive #3321 Loctite; Düsseldorf, Germany for testing dental cement
V3 UCLA Miniscope purchased on https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components for surgery/dummy baseplating/baseplating
Xylazine X1126 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO for euthanasia
Xylocaine pump spray 10% AstraZeneca; Södertälje, Sweden for surgery

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Cite This Article
Hsiao, Y., Wang, A. Y., Lee, T., Chang, C. Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice. J. Vis. Exp. (172), e62611, doi:10.3791/62611 (2021).

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