Farelerde Kalsiyum Geçici Araştırma için Objektif Lens ile Önceden Sabitlenmiş Bir Taban Kaplaması ve Miniskop Kullanımı

Floresan aktivite raporlayıcıları, nöronal aktivitenin görüntülenmesi için idealdir, çünkü hassastırlar ve geniş dinamik aralıklara sahiptirler ^1,2,3. Bu nedenle, giderek artan sayıda deney, nöronal aktiviteyi doğrudan gözlemlemek için floresan mikroskobu kullanmaktadır 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ^,16. İlk minyatür tek fotonlu floresan mikroskobu (miniskop) 2011 yılında Mark Schnitzer ve ^ark.5 tarafından tasarlanmıştır. Bu miniskop, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanlarda serebellar hücrelerin floresan dinamiklerini izlemelerini sağlar⁵ (yani, hayvanlara herhangi bir fiziksel kısıtlama, kafa kısıtlaması, sedasyon veya anestezi olmadan). Şu anda, teknik korteks 6,8,15,16 gibi yüzeysel beyin bölgelerini izlemek için uygulanabilir; dorsal hipokampus 8,11,13,14 ve striatum ^6,17 gibi subkortikal alanlar; ve ventral hipokampus 14, amigdala 10,18 ve^{hipotalamus 8,12} gibi derin beyin bölgeleri.

Son yıllarda, birkaç açık kaynaklı miniskop geliştirilmiştir.^{4,5,6,7,11,13,17,19}. Miniskop, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles (UCLA) Miniskop ekibi tarafından sağlanan adım adım yönergeleri izlerlerse araştırmacılar tarafından ekonomik olarak monte edilebilir.^4,7,11,13. Çünkü nöral aktivitenin optik izlenmesi ışık iletiminin sınırlamaları ile sınırlıdır.⁷ İlgilenilen nöronal popülasyona ve bu popülasyondan, bir röle GRIN merceğinden (veya röle lensinden) aktarılan görüş alanını büyütmek için miniskobun altına önceden sabitlenmiş objektif gradyan kırılma indisi (GRIN) lensinin (veya objektif lensin) kullanılmasını gerektiren bir miniskop tasarlanmıştır.^{6,7,8,10,16,17}. Bu röle lensi, hedef beyin bölgesine implante edilir, böylece hedef beyin bölgesinin floresan aktivitesi röle lensinin yüzeyine aktarılır.^{6,7,8,10,16,17}. Tam bir sinüzoidal ışık periyodunun yaklaşık 1 / 4’ü objektif GRIN merceğinden geçer (~ 0.25 adım) (Şekil 1A1), büyütülmüş floresan görüntü ile sonuçlanır^6,7. Objektif lens her zaman miniskopun altına sabitlenmez ve röle lensinin implantasyonu gerekli değildir.^6,7,11,13,15. Spesifik olarak, iki konfigürasyon vardır: biri miniskopta sabit bir objektif lens ve beyne implante edilmiş bir röle lensi ile^{8,10,12,14,16} (Şekil 1B1) ve sadece çıkarılabilir objektif lensli bir diğeri^6,7,11,13,15 (Şekil 1B2). Sabit objektif ve implante edilmiş röle lensi kombinasyonuna dayanan tasarımda, beyinden gelen floresan sinyalleri röle lensinin üst yüzeyine getirilir (Şekil 1A1)^{7,8,10,12,14,16}. Daha sonra, objektif lens, röle lensinin üst yüzeyinden görme alanını büyütebilir ve iletebilir (Şekil 1A2). Öte yandan, çıkarılabilir objektif GRIN lens tasarımı daha esnektir, bu da bir röle lensinin beyne önceden implante edilmesinin zorunlu olmadığı anlamına gelir (Şekil 1B2)^6,7,11,13,15. Çıkarılabilir bir objektif lens tasarımına dayanan bir miniskop kullanırken, araştırmacıların hala hedef beyin bölgesine bir lens yerleştirmeleri gerekir, ancak objektif bir lens implante edebilirler.^6,7,11,13,15 veya beyindeki bir röle lensi^6,7. İmplantasyon için objektif veya röle lensi seçimi, araştırmacının kullanması gereken miniskop konfigürasyonunu belirler. Örneğin, V3 UCLA Miniscope, çıkarılabilir bir objektif GRIN lens tasarımına dayanmaktadır. Araştırmacılar, beynin ilgilendiği bölgeye objektif bir lensi doğrudan implante etmeyi ve “boş” miniskobu objektif lense monte etmeyi seçebilirler.^6,7,11,13,15 (tek lensli bir sistem; Şekil 1B2) veya beyne bir röle lensi yerleştirmek ve objektif bir lensle önceden sabitlenmiş bir miniskop monte etmek için^6,7 (iki lensli bir sistem; Şekil 1B1). Miniskop daha sonra genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi tarafından üretilen nöronal floresanın canlı akış görüntülerini yakalamak için bir floresan kamera olarak çalışır.^1,2,3. Miniskop bir bilgisayara bağlandıktan sonra, bu floresan görüntüler bilgisayara aktarılabilir ve video klip olarak kaydedilebilir. Araştırmacılar, bazı analiz paketleriyle floresandaki göreceli değişiklikleri analiz ederek nöronal aktiviteyi inceleyebilirler.^20,21 veya gelecekteki analizler için kodlarını yazın.

V3 UCLA Miniscope, kullanıcılara nöronal aktiviteyi bir veya iki lensli bir sistemle görüntüleyip görüntülemeyeceğine karar verme esnekliği sağlar⁷. Kayıt sisteminin seçimi, hedef beyin bölgesinin derinliğine ve boyutuna dayanır. Kısacası, tek lensli bir sistem yalnızca yüzeysel (yaklaşık 2,5 mm’den daha küçük) ve nispeten büyük (yaklaşık 1,8 x 1,8^mm2’den daha büyük) bir alanı görüntüleyebilir, çünkü üreticiler yalnızca belirli bir boyutta objektif lens üretir. Buna karşılık, iki lensli bir sistem herhangi bir hedef beyin bölgesine uygulanabilir. Bununla birlikte, taban plakasını yapıştırmak için kullanılan diş çimentosu, objektif ve röle lensleri arasındaki değişen mesafe ile yanlış hizalamalara neden olma eğilimindedir ve bu da düşük görüntü kalitesine neden olur. İki lensli sistem kullanılıyorsa, optimum görüntüleme kalitesini elde etmek için iki çalışma mesafesinin tam olarak hedeflenmesi gerekir (Şekil 1A). Bu iki kritik çalışma mesafesi, röle lensinin nöronları ve alt yüzeyi arasında ve röle lensinin üst yüzeyi ile objektif lensin alt yüzeyi arasındadır (Şekil 1A1). Lensin çalışma mesafesinin dışına yanlış hizalanması veya yanlış yerleştirilmesi görüntüleme hatasına neden olur (Şekil 1C2). Buna karşılık, tek lensli sistem yalnızca bir hassas çalışma mesafesi gerektirir. Bununla birlikte, objektif lens boyutu, derin beyin bölgelerinin izlenmesi için uygulamasını sınırlar (miniskopa uyan objektif lens yaklaşık 1.8 ~ 2.0 mm ^{6,11,13,15’tir}). Bu nedenle, objektif bir lensin implantasyonu, yüzeyin ve farelerde korteks^6,15 ve dorsal cornu ammonis 1 (CA1) gibi nispeten büyük beyin bölgelerinin gözlemlenmesi için sınırlıdır^11,13 . Ek olarak, dorsal CA1 11,13’ü hedeflemek için korteksin geniş bir alanı aspire edilmelidir. Derin beyin bölgelerinin görüntülenmesini engelleyen tek lensli konfigürasyonun sınırlaması nedeniyle, ticari miniskop sistemleri yalnızca birleşik bir objektif lens / röle lensi (iki lens) tasarımı sunar. Öte yandan, V3 UCLA miniskobu tek lensli veya iki lensli bir sisteme dönüştürülebilir, çünkü objektif lensi çıkarılabilir 6,11,13,15’tir. Başka bir deyişle, V3 UCLA miniskop kullanıcıları, çıkarılabilir lensi beyne implante ederek (tek lensli bir sistem oluşturarak), yüzeysel beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken (derinliği 2,5 mm’den az) veya miniskopu önceden sabitleyerek ve beyne bir röle lensi yerleştirerek (iki lensli bir sistem oluşturarak) yararlanabilirler. derin beyin gözlemlerini içeren deneyler yaparken. İki lensli sistem, beyni yüzeysel olarak gözlemlemek için de uygulanabilir, ancak araştırmacı objektif lens ve röle lensi arasındaki doğru çalışma mesafelerini bilmelidir. Tek lensli sistemin temel avantajı, iki lensli sistemde optimum görüntüleme kalitesi elde etmek için tam olarak hedeflenmesi gereken iki çalışma mesafesi olduğu göz önüne alındığında, çalışma mesafelerini kaçırma şansının iki lensli bir sisteme göre daha düşük olmasıdır (Şekil 1A). Bu nedenle, yüzeysel beyin gözlemleri için tek lensli bir sistem kullanmanızı öneririz. Bununla birlikte, deney derin beyin bölgesinde görüntüleme gerektiriyorsa, araştırmacı iki lensin yanlış hizalanmasını önlemeyi öğrenmelidir.

Deneyler için miniskopların iki lensli konfigürasyonu için temel protokol, lens implantasyonu ve taban kaplaması ^{8,10,16,17’yi} içerir. Taban kaplaması, bir taban plakasının bir hayvanın kafasına yapıştırılmasıdır, böylece miniskop sonunda hayvanın üstüne monte edilebilir ve nöronların floresan sinyallerini videoya çekebilir (Şekil 1B). Bu prosedür, taban plakasını kafatasına yapıştırmak için diş çimentosu kullanmayı içerir (Şekil 1C), ancak diş çimentosunun büzülmesi, implante edilen röle lensi ile objektif lens ^8,17 arasındaki mesafede kabul edilemez değişikliklere neden olabilir. İki lens arasındaki kaydırılmış mesafe çok büyükse, hücreler netlemeye getirilemez.

Miniskopları kullanarak derin beyin kalsiyum görüntüleme deneyleri için ayrıntılı protokoller zaten yayınlanmıştır.^8,10,16,17. Bu protokollerin yazarları Inscopix sistemini kullanmışlardır.^8,10,16 veya diğer özelleştirilmiş tasarımlar¹⁷ ve viral seleksiyon, cerrahi ve taban plakası bağlantısı için deneysel prosedürleri tanımlamıştır. Bununla birlikte, protokolleri V3 UCLA Miniscope sistemi, NINscope gibi diğer açık kaynaklı sistemlere tam olarak uygulanamaz.⁶ve Finchscope¹⁹. İki lensin yanlış hizalanması, taban plakasını kafatasına çimentolamak için kullanılan diş çimentosu türü nedeniyle UCLA Miniscope ile iki lensli bir konfigürasyonda kayıt sırasında ortaya çıkabilir.^8,17 (Şekil 1C). İmplante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki mesafe, baz kaplama prosedürü sırasında diş çimentosunun istenmeyen büzülmesi nedeniyle kaymaya eğilimli olduğu için mevcut protokole ihtiyaç vardır. Taban kaplaması sırasında, implante edilmiş röle lensi ile objektif lens arasındaki optimum çalışma mesafesi, miniskop ile röle lensinin üst kısmı arasındaki mesafe ayarlanarak bulunmalı ve taban plakası daha sonra bu ideal konuma yapıştırılmalıdır. Objektif lens ile implante edilen röle lensi arasındaki doğru mesafe ayarlandıktan sonra, hücresel çözünürlükte uzunlamasına ölçümler elde edilebilir (Şekil 1B; in vivo kayıt). Bir röle lensinin optimum çalışma mesafesi aralığı küçük olduğundan (50 – 350 μm)^4,8, kürleme sırasında aşırı çimento büzülmesi, objektif lensin ve implante edilmiş röle lensinin uygun aralıkta tutulmasını zorlaştırabilir. Bu raporun genel amacı, büzülme sorunlarını azaltmak için bir protokol sağlamaktır.^8,17 baz kaplama işlemi sırasında meydana gelen ve iki lensli bir konfigürasyonda floresan sinyallerinin miniskop kayıtlarının başarı oranını artırmak. Başarılı miniskop kaydı, serbestçe davranan bir hayvanda bireysel nöronların floresansındaki gözle görülür göreceli değişikliklerin canlı akışının kaydedilmesi olarak tanımlanır. Farklı dental çimento markalarının farklı büzülme oranları olmasına rağmen, araştırmacılar daha önce test edilmiş bir marka seçebilirler.^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}. Bununla birlikte, tıbbi malzemeler için ithalat düzenlemeleri nedeniyle bazı ülkelerde / bölgelerde her markanın elde edilmesi kolay değildir. Bu nedenle, mevcut diş çimentolarının büzülme oranlarını test etmek ve daha da önemlisi büzülme sorununu en aza indiren alternatif bir protokol sağlamak için yöntemler geliştirdik. Mevcut baz kaplama protokolüne göre avantajı, laboratuvarlarda kolayca elde edilebilen alet ve çimento ile kalsiyum görüntülemenin başarı oranındaki artıştır. UCLA miniskobu örnek olarak kullanılır, ancak protokol diğer miniskoplar için de geçerlidir. Bu raporda, optimize edilmiş bir taban kaplama prosedürünü açıklıyoruz ve ayrıca UCLA miniskop iki lensli sistemin (Şekil 2A). UCLA miniskobu ile iki lensli konfigürasyon için hem başarılı implantasyon örnekleri (n = 3 fare) hem de başarısız implantasyon örnekleri (n = 2 fare) başarı ve başarısızlıkların nedenlerine ilişkin tartışmalarla birlikte sunulmuştur.