Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkarakterinin Kararlı İkili Kültürlerinin Kurulması

Bu protokol geliştirilirken IRB onayı aranarak onaylanmıştır (#14-10) ve tüm konulardan bilgilendirilmiş onam alınmıştır. 1. Hazırlık İnsan deneklerle çalışırken, gerekli IRB onayını ve bilgilendirilmiş onayı alın. Erken sabit faza büyümek için yeterli zamana sahip konak bakteri kültürlerine başlayın. Örneğin, 2-5 mL triptik soya suyunu% 0.1 maya özü eksik (TSBY) ile Arachnia propionica ile aşılayın ve 24 saat boyunca 37 ° C’de kuluçkaya yatırın. Filtre tutucuları paletli 0,2 μm filtre membranıyla monte edin. Montajı folyoya sarın ve otomatik olarak kaplayarak sterilize edin. Santrifüj tüplerini ve kapak montajlarını sterilize edin. 2. Oral bakteri örneği alın NOT: Birçok oral örnek Saccharibacteria (örneğin tükürük, bademcik sürüntüleri, dil kazıma) diş plağı rutin olarak en başarılı olanıdır. Steril bir kağıt noktası, Gracey curette kullanarak bir plak kazıma alın veya kendi kendine örnekleme yapıyorsanız steril bir kürdan veya pipet ucu kullanın. Planı maksimal geri kazanım seyreltici (MRD, %0,85 NaCl, %0,1 pepton) veya PBS gibi uygun bir tampona aktarın. Hemen işlenmezse, numuneyi devam etmeye hazır olana kadar buzda tutun. Diş plağını MRD tamponunda, küçük bir pipet ucu ile girdaplama ve pipetleme kombinasyonu kullanarak kuvvetli bir şekilde yeniden depolayın. Ek 9 mL MRD arabelleğine yeniden sulanmış plak örneği ekleyin. 3. Oral numuneden filtrat hazırlayın Aseptik tekniği kullanarak steril bir filtre tertibatı çözün. İpliklerin düzgün takıldığından ve cihazın düzgün bir şekilde kapatıldığından emin olmak için çeyrek dönüşü açın ve filtre tutucuyu yeniden genişletin. Bir şırıng kullanarak, 10 mL MRD tamponunu aparattan geçirerek zarı yıkayın. Filtre tutucudan sıvı sızarak bu adımda yanlış montaj ortaya çıkar. Sızıntı meydana gelirse, başka bir steril filtre tertibatı edinin ve yıkama adımını tekrarlayın. Örneği yıkanmış filtreye uygulayın. Pistonu bir şırınnadan çıkarın ve filtre cihazına takın. Şimdi 10 mL MRD tamponunda olan dağınık diş örneğini bir şırınna dökün ve filtreye yükleyin. Filtratı yakalamak için filtre cihazının altına steril bir santrifüj tüpü yerleştirin, ardından numuneyi filtreden geçirmek için pistona hafif basınç uygulayın. Membranı yıkamak için işlemi 10 mL daha MRD tamponu ile tekrarlayın ve akışı filtrelenmiş numuneyle aynı tüpte toplayın. Aseptik olarak tüpü kapla. 4. Saccharibacteria hücrelerini santrifüjleme ile konsantre edin Tüp ve kapak üzerinde bir oryantasyon işareti yapın ve tüpü üst taraftaki işaretle birlikte yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden oluşan pelet genellikle görünmezdir. İşaretleme, santrifüjleme yapıldığında ve tüp santrifüjden çıkarıldığında Saccharibacteria hücrelerinin peletinin nerede bulunduğunu belirlemeye yardımcı olacaktır. Numuneleri 60.000 x g’da 4 °C’de 1 saat boyunca santrifüj edin.NOT: Bu kuvvet ve zaman tüm Saccharibacteria hücrelerini peletmek için yeterlidir. Bununla birlikte, Saccharibacteria hücreleri en azından 20.000 x g’da20 dakika kadar kısa bir süre santrifüjleme ile kısmen peletlenebilir. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Peletin tüpün üst tarafında tutularak sıvıyı tüpten dökün. Genellikle görünmez peletin 1-2 mL MRD tamponunda güçlü girdap ile yeniden depolansın. 5. Ev sahibi kültürlere Saccharibacteria ile zenginleştirilmiş filtrat bulaştırın 2 mL uygun büyüme ortamını (örneğin, TSBY, BHI, vb.) tüplere ayırarak kültür tüpleri hazırlayın. Her tüpe 200 μL konak organizma kültürü ekleyin. Her tüpe 100-200 μL resüspended, filtrelenmiş numune ekleyin. Kombine numuneleri konak organizma için uygun şekilde kuluçkaya yatırın (örneğin, 37 °C, A. propionicaiçin aerobik bir atmosferde). Yeni bir tüpte 200 μL ikili kültürü 2 mL taze büyüme ortamına aktararak hücreleri iki ila üç günde bir aktarın. Geçişli kültürlerin büyüme göstermediği görülürse (yani, kültürün bulanıklığı / optik yoğunluğu taze ortama geçtikten sonra artmaz) Saccharibacteria tüm konak organizmayı ezici veya öldürebilir. Bunu düzeltmek için, hücreleri geçirirken 200 μL enfekte olmayan konak kültürü ekleyin. En az 5 pasaj için tekrarlayın. 6. PCR ile enfeksiyonu onaylayın 5 pasajdan sonra PCR ile enfeksiyonu onaylayın. Beş pasaj, büyümeyen Saccharibacteria hücrelerinin 25 pcr döngüsü kullanılarak algılama sınırının ötesinde tükenmesini sağlayacaktır. Bir PCR mastermix hazırlayın. Önerilen bir tarif aşağıdaki gibidir, ihtiyaç duyulan her tüp için 12,5 μL 2x PCR tamponu hazırlayın, 0,75 μL 10 μM İleri astar (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL 10 10μM Ters astar (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC), 1 μL 25 mM MgCl2 ve 9 μL su. Girdapla karıştırın. Aliquot 24 μL mastermiks 0.2 mL PCR tüpüne. PCR reaksiyona 1 μL Saccharibacteria bulaşmış kültür ekleyin. Tüpü bir termosikleme içine yerleştirin ve aşağıdaki protokolü gerçekleştirin: İlk denatürasyon 95 °C 5 dakika, 25 döngü 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s, son uzama 72 °C 2 dakika, sonra 4 °C’de son tutma. PCR ürünlerini % 1 agarose jelde yükleyin ve çalıştırın. ~600 bazlı bir grup Saccharibacteria’nın varlığını gösterecektir. 7. Saflık olup olmadığını kontrol edin ve kirletici organizmaları çıkarın Saccharibacteria’nın kokültürünü konak organizmanın büyümesi için yeterli besin agarı üzerine kaplayarak pozitif kültürlerin saflığını onaylayın. Kültürün steril tamponda (örneğin MRD veya PBS) 10 kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve bir agar plakasına 100 μL yayın. Agar plakasında yaklaşık 20-200 koloninin büyüyeceği şekilde seyreltmeler gerçekleştirin. Kültürü uygun büyüme koşullarında kuluçkaya yatırın ve kirletici organizmalar için gözlemleyin.NOT: Axenik Sakkaribakteri kolonileri hiç gözlenmemiştir, bu nedenle bu plakalarda sadece konak organizmanın büyüdüğü gözlenir. Birden fazla koloni tipi genellikle kirlenmeyi gösterir. Kontaminasyon meydana gelirse, kültür istenmeyen kirleticileri gidermek için yeniden filtrelenmeli ve taze konakçıya yeniden aşılanmalıdır. Bazen iki Saccharibacteria türünün aynı konağı enfekte ettiği çift enfeksiyon meydana gelir. Saccharibacteria türlerini ayırmak için, 20 μL steril PBS’de tek tek kolonileri yeniden kullanın ve Saccharibacteria enfeksiyonu olan kolonileri tespit etmek için PCR reaksiyonunda 1 μL süspansiyon kullanın. İkili bir kültür başlatmak için büyüme ortamına olumlu sonuç veren askıya almaları aktarın. Başarı oranı, kültürdeki her Saccharibacteria türünün titrekliğine bağlı olacaktır. Yayılma için enfekte bir koloni bulmak için 50’den fazla koloniyi taramak gerekebilir. 8. Kültürlerin depolanmasını Bir gecede yeterli hacimde (10-50 mL) ikili bir kültür büyütün. Santrifüjleme ile pelet hücreleri (10 dakika boyunca 4.000 x g).NOT: Saccharibacteria hücreleri konağın daha büyük, daha ağır hücrelerine bağlanacağı ve onlarla peletileceği için burada yüksek hızlı santrifüjleme gerekli değildir. Hücreleri kriyoprotektantta yeniden biriktirin. %5 DMSO veya gliserol ile desteklenmiş büyüme ortamı genellikle yeterlidir. Konak organizmanın kriyoprotektör ortamla uyumlu olduğundan emin olun (örneğin, A. propionica büyümesi gliserol tarafından inhibe edilir ve dondurulmuş stoklar canlanmayabilir). Stokların donmada hayatta kalabilmesini sağlamak için enfekte olmayan bir konak kültürünün canlılığını kriyoprotektant ile test edin. Hücre peletini aynı kültür hacminde (10-50 mL) yeniden dirildi. Etiketli cryovials içine Aliquot 0.5 mL. Hücre kültürlerini -80 °C’de dondurun.