Создание стабильных бинарных культур симбиотических сахариобактерий из полости рта

При разработке этого протокола было запрошено и одобрено одобрение IRB (#14-10) и получено информированное согласие от всех субъектов. 1. Подготовка При работе с людьми получите необходимое одобрение IRB и информированное согласие. Запускайте культуры бактерий-хозяев с достаточным временем для роста до ранней стационарной фазы. Например, привить 2-5 мл триптического соевого бульона с добавлением 0,1% дрожжевого экстракта (TSBY) с Arachnia propionica и инкубировать при 37 °C в течение 24 ч. Сборка фильтродержателей с вытравленной гусеничной мембраной фильтра 0,2 мкм. Оберните сборку в фольгу и стерилизуйте автоклавом. Стерилизуйте центрифужные трубки и колпачки в сборе. 2. Получение образца бактерий полости рта ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как многие образцы полости рта содержат сахариактерии (например, слюну, мазки миндадин, соскобы языка), зубной налет обычно является наиболее успешным. Возьмите соскоб зубного налета с помощью стерильной бумажной точки, кюретки Грейси, или, если вы самостоятельно берете пробы, используйте стерильную зубочистку или наконечник пипетки. Перенесите бляшки в подходящий буфер, такой как максимальный восстановительный разбавлятель (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% пептон) или PBS. Если образец не обработан немедленно, держите образец на льду до тех пор, пока он не будет готов к продолжению. Энергично повторно суспендирует зубной налет в буфере MRD, используя комбинацию вихрей и пипетки с небольшим наконечником пипетки. Добавьте образец повторно суспендированного бляшки в дополнительные 9 мл буфера MRD. 3. Приготовьте фильтрат из перорального образца Используя асептическую технику, развернить стерильный фильтр в сборе. Раскрутите четверть оборота и запрячь фильтродержатель, чтобы убедиться, что резьба правильно задействована и устройство закрыто должным образом. С помощью шприца промыть мембрану, пройдя через аппарат 10 мл буфера MRD. Неправильная сборка выявляется на этом этапе утечкой жидкости из фильтродержателя. При возникновении утечки приобретите другой стерильный фильтр в сборе и повторите этап промывки. Нанесите образец на промытый фильтр. Извлеките плунжер из шприца и прикрепите его к фильтрующей аппаратуре. Перелейте дисперсный стоматологический образец, теперь в 10 мл буфера MRD, в шприц и загрузите его на фильтр. Поместите стерильную центрифужную трубку под фильтрующим устройством, чтобы уловить фильтрат, затем приложите легкое давление к плунжеру, чтобы протолкнуть образец через фильтр. Повторите процедуру с еще 10 мл буфера MRD, чтобы промыть мембрану, собирая проточную часть в той же пробирке, что и отфильтрованный образец. Асептически запачкать трубку. 4. Концентрирование клеток сахариобактерий путем центрифугирования Сделайте ориентировочную отметку на трубке и крышке и поместите трубку в высокоскоростную центрифугу с отметкой на верхней стороне. Гранула, образованная в результате центрифугирования, обычно невидима. Маркировка поможет определить, где находится гранула клеток сахариобактерий, когда производится центрифугирование и трубка удаляется из центрифуги. Центрифугировать образцы при 60 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Этой силы и времени достаточно, чтобы гранулировать все клетки сахариобактерий. Тем не менее, клетки сахарибактерий могут быть, по меньшей мере, частично гранулированы центрифугированием всего за 20 минут при 20 000 х г. Осторожно извлеките трубки из центрифуги. Вылейте жидкость из трубки, держа гранулу на верхней стороне трубки. Повторное суспендирование обычно невидимой гранулы в 1-2 мл буфера MRD путем энергичного вихря. 5. Заражение культур-хозяев фильтратом, обогащенным сахариактериями Подготавливайте культуры путем алицитирования 2 мл соответствующих питательных сред (например, TSBY, BHI и т.д.) в пробирки. Добавьте 200 мкл ночной культуры организмов-хозяев в каждую трубку. Добавьте 100-200 мкл повторно суспендированного, отфильтрованного образца в каждую пробирку. Инкубировать комбинированные образцы, подходящие для организма-хозяина (например, 37 °C, в аэробной атмосфере для A. propionica). Пропускают клетки каждые два-три дня путем переноса 200 мкл бинарной культуры на 2 мл свежей питательной среды в новой пробирке. Если окажется, что проходные культуры не показывают роста (т. Е. Мутность / оптическая плотность культуры не увеличивается после перехода в свежие среды), сахариобактерии могут быть подавляющими или убивать весь организм-хозяин. Чтобы исправить это, добавьте 200 мкл неинфицированной культуры хозяина при прохождении клеток. Повторите не менее 5 проходов. 6. Подтвердите инфекцию с помощью ПЦР После 5 проходов подтверждают заражение ПЦР. Пять проходов гарантируют, что любые нерастающие клетки сахариактерий будут истощены сверх предела обнаружения с использованием 25 циклов ПЦР. Подготовьте мастермикс ПЦР. Предлагаемый рецепт использования заключается в следующем: для каждой необходимой трубки готовят 12,5 мкл 2x буфера ПЦР, 0,75 мкл 10 мкМ Прямой грунтовки (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 мкл 10 мкМ Обратная грунтовка (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC), 1 мкл 25 мМ MgCl2 и 9 мкл воды. Перемешивать путем вихря. Аликвот 24 мкл мастермикса в ПЦР-трубку 0,2 мл. Добавьте 1 мкл культуры, инфицированной сахарибактериями, к реакции ПЦР. Поместите трубку в термоциклер и выполните следующий протокол: начальная денатурация 95 °C в течение 5 мин, 25 циклов 95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с, окончательное удлинение при 72 °C в течение 2 мин, затем окончательная удлинение при 4 °C. Загрузите и запустите продукты ПЦР в 1% агарозном гелевом. Полоса из ~600 оснований будет указывать на наличие сахариобактерий. 7. Проверьте чистоту и удалите загрязняющие организмы Подтвердить чистоту положительных культур, покрыв кокультуру сахариобактерий питательным агаром, достаточным для роста организма-хозяина. Выполняют 10-кратное последовательное разведение культуры в стерильный буфер (например, MRD или PBS) и выкладывают 100 мкл на агаровую пластину. Выполняйте разведения таким образом, чтобы на агаре росло примерно 20-200 колоний. Инкубируют культуру в соответствующих условиях роста и наблюдают за загрязняющими организмами.ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии аксеновых сахариактерий никогда не наблюдались, поэтому на этих пластинах растет только организм-хозяин. Более одного типа колонии обычно указывает на загрязнение. В случае загрязнения культуру следует повторно отфильтровать для удаления нежелательных загрязнений и повторно привить свежему хозяину. Иногда происходит двойная инфекция, когда два вида сахариактерий заражают одного и того же хозяина. Чтобы отделить виды сахариобактерий, повторно суспендировать отдельные колонии в 20 мкл стерильной PBS и использовать 1 мкл суспензии в реакции ПЦР для обнаружения колоний с инфекциями сахариобактерий. Перенесите суспензии, давшие положительный результат, в питательную среду, чтобы запустить бинарную культуру. Показатель успеха будет зависеть от титра каждого вида сахариактерий в культуре. Может потребоваться скрининг более 50 колоний, чтобы найти зараженную для размножения. 8. Хранение культур Вырастите бинарную культуру достаточного объема (10-50 мл) за ночь. Пеллетные ячейки центрифугированием (4 000 х г в течение 10 мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Высокоскоростное центрифугирование здесь не требуется, так как клетки сахарибактерий будут прикреплены к более крупным и тяжелым клеткам хозяина и будут гранулироваться вместе с ними. Повторное суспендация клеток в криопротекторе. Обычно достаточно питательных сред, дополненных либо 5% ДМСО, либо 20% глицерина. Убедитесь, что организм-хозяин совместим с криопротекторными средами (например, рост A. propionica ингибируется глицерином, и замороженные запасы могут не возрождаться). Проверьте жизнеспособность неинфицированной культуры хозяина с помощью криопротектора, чтобы убедиться, что запасы могут пережить замораживание. Повторно суспендируют клеточную гранулу в том же объеме культуры (10-50 мл). Аликвот 0,5 мл в меченые криовиалы. Заморозить клеточные культуры при -80 °C.