口腔から共生サッカリバクテリアの安定したバイナリ培養を確立する

このプロトコルを開発する際、IRBの承認を求め、承認(#14-10)、インフォームド・コンセントはすべての対象から得られた。 1. 準備 人間の被験者と協力する場合は、必要なIRBの承認とインフォームド・コンセントを取得します。 早期定常段階に成長するのに十分な時間を持つ宿主細菌の培養を開始する。例えば、0.1%酵母エキスを加えたトリプティック大豆ブロス2〜5mLを アラクニアプロピオンカ で2〜5mL(TSBY)し、37°Cで24時間インキュベートする。 トラックエッチングされた0.2 μmのフィルター膜を用いてフィルターホルダーを組み立てます。ホイルでアセンブリを包み、オートクレーブで殺菌します。 遠心管およびキャップアセンブリを殺菌する。 2. 口腔内細菌のサンプルを入手する 注:多くの経口サンプルにはサッカリバクテリア(例えば、唾液、扁桃の綿棒、舌の擦り傷)が含まれていますが、歯垢は日常的に最も成功しています。 滅菌紙の点、グレーシーキュレットを使用してプラークスクレイピングを取るか、または、自己サンプリングの場合は、無菌の爪楊枝またはピペットチップを使用してください。プラークを適切なバッファーに移し、例えば、最大回収希釈剤(MRD、0.85% NaCl、0.1%ペプトン)またはPBS。すぐに処理されない場合は、サンプルを氷の上に置いて、準備が整うまで保管してください。 小さなピペットチップを使用して、ボルテックスとピペットの組み合わせを使用して、MRDバッファー内の歯垢を激しく再中断します。 再懸濁したプラークサンプルを追加の9 mLのMRDバッファーに追加します。 3. 口腔試料から濾液を準備する 無菌技術を使用して、無菌フィルターアセンブリをアンラップします。4分の1回転を外し、フィルターホルダーを締め直して、スレッドが適切に係合され、装置が適切に閉じられていることを確認します。注射器を用いて、10mLのMRDバッファーを装置に通して膜を洗浄する。不適切なアセンブリは、フィルターホルダーから漏出流体によって、このステップで明らかにされます。漏れが生じた場合は、別の滅菌フィルターアセンブリを取得し、洗浄工程を繰り返します。 洗浄したフィルターにサンプルを塗布します。シリンジからプランジャーを取り出し、フィルター装置に取り付けます。10 mLのMRDバッファーに分散した歯科サンプルを注射器に注ぎ、フィルターに積み込みます。 フィルター装置の下に無菌遠心管を置いて濾液を捕捉し、プランジャーに軽い圧力をかけてサンプルをフィルターに押し込みます。 別の10 mLのMRDバッファーで手順を繰り返して膜を洗浄し、濾過サンプルと同じチューブにフロースルーを収集します。無菌でチューブをキャップします。 4. 遠心分離によるサッカリバクテリア細胞の濃縮 チューブとキャップに向きマークを付け、上部にマークが付いた高速遠心分離機にチューブを配置します。遠心分離から形成されたペレットは、通常は見えない。このマーキングは、遠心分離が行われ、チューブが遠心分離から取り除かれたときに、サッカリバクテリア細胞のペレットがどこに位置するかを決定するのに役立ちます。 サンプルを4°Cで1時間60,000xgで遠心分離する。 注:この力と時間は、すべてのサッカリバクテリア細胞をペレットするのに十分です。しかし、サッカリバクテリア細胞は、20,000 x gでわずか20分間の遠心分離によって少なくとも部分的にペレット化することができる。 慎重に遠心分離機からチューブを取り外します。チューブの上側にペレットを保ち、チューブから液体を注ぎます。 通常、不可視ペレットを活発な渦を通してMRDバッファーの1〜2 mLに再懸濁する。 5. サッカリバクテリアを豊富に含む濾液で宿主培養物に感染する 適切な成長培地(例えば、TSBY、BHIなど)の2 mLをチューブにアリクォートして培養管を調製する。 各チューブに宿主生物の一晩培養200μLを加えます。各チューブに100~200μLの再懸濁されたフィルターサンプルを加えます。 インキュベートは、宿主生物に適したサンプルを組み合わせた(例えば、37°C、A. プロピオンカの好気性雰囲気中)。 200 μLのバイナリー培養を新しいチューブで2 mLの新鮮な成長培地に移すことによって、2~3日ごとに細胞を通過させる。通過培養物が成長を示さないと思われる場合(すなわち、新鮮な培地に通った後に培養の濁度/光学密度が増加しない)、サッカリバクテリアは、すべての宿主生物を圧倒または殺す可能性があります。これを改善するには、細胞を通過させるときに感染していない宿主培養物を200μL加える。5箇所以上を繰り返します。 6. PCRによる感染の確認 5つの通路の後、PCRによる感染を確認する。5つの通路は、PCRの25サイクルを使用して検出の限界を超えて枯渇している非成長サッカリバクテリア細胞よりも保証されます。 PCR マスターミックスを準備します。推奨レシピは以下の通り、必要な各チューブに対して、 12.5 μL 2x PCR バッファー、0.75 μL 10 μM フォワードプライマー (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C)、0.75 μL 10 μM リバースプライマー(1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCTCC)、1 μL 25mMM および 9mMMg 2MMMM および 9mM Mg 9MMMM および 9 μL渦を混ぜます。 0.2 mL PCRチューブにマスターミックスのアリコート24 μL。1 μLのサッカリバクテリア感染培養液をPCR反応に加えます。チューブをサーモサイクラーに入れ、次のプロトコルを実行します:最初の変性95°C5分、30sの95°Cの25サイクル、30sの60°C、30sの72°C、72°Cでの最終伸びを2分間、そして4°Cで最終保持します。 PCR産物を1%アガロースゲルでロードして実行します。600塩基のバンドは、サッカリバクテリアの存在を示します。 7. 純度を確認し、汚染生物を除去する 宿主生物の増殖に十分な栄養寒天にサッカリバクテリアの共培養をめっきすることにより、陽性培養物の純度を確認する。滅菌バッファー(MRDまたはPBSなど)で培養液の10倍の連続希釈を行い、寒天プレートに100 μLを広げます。寒天プレート上に約20〜200コロニーが生育するような希釈を行う。 適切な成長条件で培養をインキュベートし、微生物を汚染することを観察する。注:アキセン性サッカリバクテリアコロニーは一度も観察されていないので、これらのプレート上で増殖しているのは宿主生物のみが観察されています。複数のコロニータイプは通常、汚染を示す。汚染が発生した場合、培養物を再濾過して不要な汚染物質を除去し、新鮮な宿主に再接種する必要があります。 時には二重感染が起こり、2種のサッカリバクテリアが同じ宿主に感染する。サッカリバクテリア種を分離するには、20 μLの滅菌PBSで個々のコロニーを再懸濁し、1 μLの懸濁液をPCR反応に使用して、サッカリバクテリア感染のコロニーを検出します。 バイナリカルチャを開始するために成長培地に肯定的な結果を与えた懸濁液を転送します。.成功率は、培養中の各サッカリバクテリア種の火長に依存します。感染したコロニーを見つけるために50以上のコロニーをスクリーニングする必要があるかもしれません。 8. 文化の保管 一晩で十分な容積(10-50 mL)のバイナリ培養を成長させる。 遠心分離によるペレット細胞(10分間4,000xg)。 注:サッカリバクテリア細胞は宿主のより大きく、重い細胞に結合し、それらとペレットになるので、高速遠心分離はここでは必要ありません。 凍結保護剤の細胞を再中断します。5%DMSOまたは20%グリセロールのいずれかを補った成長培地は、通常十分である。宿主生物が凍結保護剤媒体と互換性があることを確認してください(例えば 、A.プロピオンカ の成長はグリセロールによって阻害され、凍結したストックは復活しない可能性があります)。凍結保護剤で感染していない宿主培養の生存率をテストし、在庫が凍結して生き残ることを確認します。 同じ培養液中の細胞ペレットを再懸濁(10〜50mL)。アリコート 0.5 mL ラベル付きクライオビアルに。細胞培養物を-80°Cで凍結する。