הקמת תרבויות בינאריות יציבות של סקרייבקטריה סימביוטית מחלל הפה

בעת פיתוח פרוטוקול זה, אישור IRB היה מבוקש ואושר (#14-10) והסכמה מדעת הושגה מכל הנושאים. 1. הכנה בעת עבודה עם נבדקים אנושיים, לקבל אישור IRB הדרוש והסכמה מדעת. התחל תרבויות של חיידקים מארחים עם מספיק זמן לגדול לשלב נייח מוקדם. לדוגמה, לחסן 2-5 מ”ל של מרק סויה טריפטית עם 0.1% תמצית שמרים הוסיף (TSBY) עם Propionica Arachnia ודגרת ב 37 °C (69 °F) עבור 24 שעות. הרכב מחזיקי מסנן עם קרום מסנן 0.2 מיקרומטר חרוט. לעטוף את ההרכבה בנייר כסף ולעקר על ידי autoclaving. לעקר צינורות צנטריפוגה ומכלולי כובעים. 2. השג דגימה של חיידקי הפה הערה: בעוד דגימות אוראליות רבות מכילות Saccharibacteria (למשל, רוק, ספוגיות של שקדים, שריטות לשון) רובד שיניים באופן שגרתי הוא המוצלח ביותר. קח גירוד פלאק באמצעות נקודת נייר סטרילית, קורט גרייסי, או, אם דגימה עצמית, להשתמש קיסם סטרילי או קצה פיפטה. לוחית העברה למאגר מתאים, כגון דילול שחזור מקסימלי (MRD, 0.85% NaCl, 0.1% פפטון) או PBS. אם לא מעובד באופן מיידי, לשמור את המדגם על הקרח עד מוכן להמשיך. במרץ resuspend את רובד השיניים במאגר MRD באמצעות שילוב של מערבולת צינור עם קצה צינור קטן. הוסף דגימת פלאק לשימוש חוזר למאגר MRD נוסף של 9 מ”ל. 3. הכן סינון מדגם אוראלי בטכניקה אספטית, בטלו את התוסף של מכלול מסנן סטרילי. בטל את ההפעלה של רבע סיבוב והפעל מחדש את מחזיק המסנן כדי לוודא שהאשכולות מופעלים כראוי והמנגנון סגור כראוי. באמצעות מזרק, לשטוף את הממברנה על ידי העברת 10 מ”ל של חיץ MRD דרך המנגנון. הרכבה לא נכונה מתגלה בשלב זה על ידי נוזל דולף מתוך מחזיק המסנן. במקרה של דליפה, השג הרכבה סטרילית נוספת של המסנן וחזור על שלב הכביסה. החל את המדגם על המסנן שנשטף. הסר את הוכנה ממזרק וחבר אותה למנגנון הסינון. יוצקים את דגימת השיניים המפוזרת, עכשיו ב 10 מ”ל של מאגר MRD, לתוך מזרק לטעון אותו על המסנן. מניחים צינור צנטריפוגה סטרילי מתחת למנגנון המסנן כדי לתפוס את הסינון, ולאחר מכן להחיל לחץ אור על הבוכנה כדי לדחוף את המדגם דרך המסנן. חזור על ההליך עם עוד 10 מ”ל של מאגר MRD לשטוף את הממברנה, איסוף הזרימה דרך באותו צינור כמו מדגם מסונן. מכסה את הצינור בצורה לא מתאימה. 4. לרכז את תאי Saccharibacteria על ידי צנטריפוגה לעשות סימן התמצאות על הצינור ואת הכובע ומניחים את הצינור בצנטריפוגה במהירות גבוהה עם הסימן בצד העליון. גלולה שנוצר צנטריפוגה הוא בדרך כלל בלתי נראה. הסימון יעזור לקבוע היכן הכדור של תאי Saccharibacteria ממוקם כאשר צנטריפוגה נעשית הצינור הוסר מן הצנטריפוגה. צנטריפוגה הדגימות ב 60,000 x g עבור 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס.הערה: כוח זה וזמן מספיק כדי גלולות כל התאים Saccharibacteria. עם זאת, תאים Saccharibacteria יכול להיות לפחות חלקית pelleted על ידי צנטריפוגה עבור קטן כמו 20 דקות ב 20,000 xg . הסר בזהירות את הצינורות מצנטריפוגה. יוצקים את הנוזל מהצינור, שמירה על גלולה בצד העליון של הצינור. Resuspend גלולה בלתי נראית בדרך כלל ב 1-2 מ”ל של מאגר MRD על ידי מערבולת נמרצת. 5. להדביק תרבויות מארחות עם סינון מועשר בסכריבקטריה הכן צינורות תרבות על ידי aliquoting 2 מ”ל של מדיה צמיחה מתאימה (למשל, TSBY, BHI, וכו ‘) לתוך צינורות. הוסף 200 μL של תרבות לילה של אורגניזמים מארחים לכל צינור. הוסף 100-200 μL של resuspended, מדגם מסונן לכל צינור. דגירה משולבת דגימות בהתאם המתאים האורגניזם המארח (למשל, 37 °C (69 °F), באווירה אירובית עבור A. propionica). מעבר התאים כל יומיים עד שלושה ימים על ידי העברת 200 μL של תרבות בינארית ל 2 מ”ל של מדיום צמיחה טרי בצינור חדש. אם נראה כי תרבויות המעבר אינן מראות צמיחה (כלומר, הצפיפות השעורה /האופטית של התרבות אינה גדלה לאחר המעבר למדיה טרייה) הסכריבקטריה יכולה להיות מהממת או להרוג את כל האורגניזם המארח. כדי לתקן זאת, להוסיף 200 μL של תרבות מארחת לא מושפעת בעת העברת התאים. חזור על הפעולה לפחות 5 קטעים. 6. אשר זיהום על ידי PCR לאחר 5 קטעים, לאשר זיהום עם PCR. חמישה קטעים יבטיחו יותר מכל תאי Saccharibacteria שאינם גדלים התרוקנו מעבר לגבול הגילוי באמצעות 25 מחזורים של PCR. הכן מאסטרמיקס PCR. מתכון מוצע באמצעות הוא כדלקמן, עבור כל צינור צורך, להכין 12.5 μL 2x PCR מאגר, 0.75 μL 10 מיקרומטר קדימה פריימר (580F12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0.75 μL 10 פריימר הפוך מיקרומטר (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT TCC), 1 μL 25 מ”מ MgCl2 ו 9 מ”ל מים. מערבבים על ידי מערבולת. Aliquot 24 μL של מאסטרמיקס לתוך צינור PCR 0.2 מ”ל. הוסף 1 μL של תרבות נגועה Saccharibacteria לתגובת PCR. מניחים את הצינור בתרמוציקלר ומבצעים את הפרוטוקול הבא: denaturation הראשונית 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 s, 60 °C (60 °F) עבור 30 °C (72 °F) עבור 30 s, התארכות סופית ב 72 °C (72 °F) למשך 2 דקות, ולאחר מכן אחיזה סופית ב 4 °C (60 °F). לטעון ולהפעיל את מוצרי PCR ב 1% ג’ל agarose. להקה של ~ 600 בסיסים יצביעו על נוכחותו של Saccharibacteria. 7. בדוק טוהר ולהסיר אורגניזמים מזהמים אשר טוהר של תרבויות חיוביות על ידי ציפוי coculture של Saccharibacteria על אגר מים מזינים מספיק לצמיחה של האורגניזם המארח. בצע דילול סדרתי פי 10 של התרבות במאגר סטרילי (למשל, MRD או PBS) והתפשט 100 μL על צלחת אגר. בצע דילול כך שיהיו כ 20-200 מושבות גדל על צלחת אגר. דגירה התרבות בתנאי צמיחה מתאימים להתבונן אורגניזמים מזהמים.הערה: מושבות Saccharibacteria Axenic מעולם לא נצפו, כך שרק האורגניזם המארח נצפה גדל על הצלחות האלה. יותר מסוג מושבה אחד בדרך כלל מצביע על זיהום. אם זיהום מתרחש, התרבות צריכה להיות מסוננת מחדש כדי להסיר את המזהמים לא רצויים מחוסנים מחדש על מארח טרי. מדי פעם מתרחש זיהום כפול, שבו שני מינים Saccharibacteria להדביק את אותו מארח. כדי להפריד את המינים Saccharibacteria, resuspend מושבות בודדות ב 20 μL סטרילי PBS ולהשתמש 1 μL של השעיה בתגובת PCR כדי לזהות מושבות עם זיהומים Saccharibacteria. העבר את ההשעיות שנתנו תוצאה חיובית למדיום צמיחה כדי להתחיל תרבות בינארית. שיעור ההצלחה יהיה תלוי בטיטר של כל מין Saccharibacteria בתרבות. ייתכן שיהיה צורך לסנן יותר מ -50 מושבות כדי למצוא אחד נגוע להפצה. 8. אחסון תרבויות הגדל תרבות בינארית של נפח מספיק (10-50 מ”ל) בן לילה. כדורי תאים על ידי צנטריפוגה (4,000 x g במשך 10 דקות).הערה: צנטריפוגה במהירות גבוהה אינה נחוצה כאן כמו תאי Saccharibacteria יהיה מחובר לתאים גדולים יותר, כבדים יותר של המארח יהיה גלולה איתם. יש לוותר מחדש על תאים בהקפאה. מדיה צמיחה בתוספת או 5% DMSO או 20% גליצרול הוא בדרך כלל מספיק. ודא כי האורגניזם המארח תואם עם מדיה cryoprotectant (למשל, צמיחה של A. propionica מעוכבת על ידי גליצרול מניות קפואות לא יכול להחיות). בדוק את הכדאיות של תרבות מארחת לא מושפעת עם cryoprotectant כדי להבטיח מניות יכול לשרוד הקפאה. גלולת תא resuspend באותו נפח של תרבות (10-50 מ”ל). Aliquot 0.5 מ”ל לתוך cryovials שכותרתו. להקפיא תרביות תאים ב -80 מעלות צלזיוס.