إنشاء ثقافات ثنائية مستقرة من Saccharibacteria التكافلية من تجويف الفم
Summary
نحن نظهر طريقة لعزل الأعضاء الذين يصعب نموهم في رواية الفيلوم البكتيري ، Saccharibacteria ، من خلال تصفية لوحة الأسنان والزرع المشترك مع البكتيريا المضيفة.
Abstract
لا يمكن استزراع العديد من الأنواع البكتيرية في المختبر باستخدام أساليب قياسية ، مما يشكل حاجزا كبيرا أمام دراسة غالبية التنوع الميكروبي على الأرض. وهناك حاجة إلى نهج جديدة لزراعة هذه البكتيريا غير المستزرعة حتى يتمكن المحققون من دراسة فسيولوجيا ونمط حياتهم بشكل فعال باستخدام الأدوات القوية المتاحة في المختبر. تعد إشعاعات فيلة المرشحة (CPR) واحدة من أكبر مجموعات البكتيريا غير المزروعة ، والتي تشكل ~ 15٪ من التنوع الحي على الأرض. وكان أول عزل لهذه المجموعة عضوا في فيلوم Saccharibacteria،‘Nanosynbacter lyticus’سلالة TM7x. TM7x هي بكتيريا صغيرة بشكل غير عادي التي تعيش كمدميون في اتصال مباشر مع مضيف بكتيري، شاليا odontolytica، سلالة XH001. الاستفادة من حجم الخلية الصغيرة بشكل غير عادي وأسلوب حياتها ككائن حي تكافلي، وضعنا بروتوكولا لثقافة بسرعة Saccharibacteria من لوحة الأسنان. هذا البروتوكول سوف تظهر كيفية تصفية تعليق لوحة الأسنان من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر، ثم تركيز خلايا Saccharibacteria التي تم جمعها وتصيب ثقافة الكائنات الحية المضيفة. ويمكن تمرير الزراعة المشتركة الناتجة عن ذلك كما يتم تأكيد أي ثقافة البكتيرية العادية والعدوى عن طريق PCR. ويمكن الحفاظ على الثقافة الثنائية الناتجة في المختبر واستخدامها للتجارب المستقبلية. في حين أن التلوث هو احتمال, يمكن تنقية الثقافة الثنائية إما عن طريق تصفية مزيد من وإعادة العدوى من المضيف, أو عن طريق طلاء الثقافة الثنائية وفحص المستعمرات المصابة. ونأمل أن يتم توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أنواع العينات والبيئات الأخرى، مما يؤدي إلى زراعة العديد من الأنواع الأخرى في الإنعاش القلبي الرئوي.
Introduction
زراعة أنواع جديدة من البكتيريا وجلبها إلى المختبر يسمح لتجارب قوية لفهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء والتفاعلات الأوسع داخل مجتمعهم الميكروبي. وفي حين أن هناك أساليب خالية من الثقافة لاستجواب هذه الأسئلة (مثل “الاقتصاد التلوي”)، فإن التفاعلات المعقدة بين مجموعات الميكروبات المتنوعة تجعل من الصعب تفريق المتغيرات الفردية والتوصل إلى استنتاجات ذات مغزى. في حين أن زراعة البكتيريا لها فوائد عديدة ، هناك العديد من الحواجز المحتملة لعزل البكتيريا وزراعة في الثقافة النقية. وتشمل متطلبات النمو المحددة المحتملة الحموضة، والتوتر الأكسجين، والفيتامينات، وعوامل النمو، والجزيئات الإشارات أو حتى الاتصال المباشر الخلية للحصول على النمو1. ومع ذلك ، يعتقد أن auxotrophies محددة هي الرادع الرئيسي لزراعة أنواع جديدة من البكتيريا. تفتقر تركيبات الوسائط القياسية إلى العديد من العناصر الغذائية التي تتطلبها البكتيريا غير المزروعة، مثل الفيتامينات أو مصادر الكربون المحددة. هذه الجزيئات المفقودة يمكن أن تكون المفتاح لعلم وظائف الأعضاء من البكتيريا غير المستزرعة وعادة ما يتم توفيرها من قبل كائن آخر في المجتمع الميكروبي أو كائن حي مضيف. على سبيل المثال، يمكن توفير الكربوهيدرات المعقدة مثل الموسين من قبل مضيفي الحيوانات. إضافة هذه إلى وسائل الإعلام سمحت زراعة العديد من البكتيريا من أحشاء الحيوانات، بما في ذلك أكرمانسيا muciniphila وMucinivorans hirudinis2،3،4. وقد تطورت العديد من البكتيريا المسببة للأمراض القدرة على استخدام الحديد ملزمة الهيمين في الخلايا الحيوانية، بما في ذلك الممرض الفموي بورفيرموناس gingivalis5. في المختبر ، يمكن تحفيز نمو البورفيرومونات والكائنات الحية الأخرى ، عن طريق إضافة الهيمين6.
في الآونة الأخيرة ، العديد من الاختراقات في زراعة عزلات جديدة من البكتيريا قد حان من خلال زراعة مشتركة ، وذلك باستخدام كائن حي “المغذية” لتوفير عوامل محددة للبكتيريا غير المستثناة اللازمة لنموها. أظهرت دراسة أنيقة أجراها فارتوكيان وزملاؤه أن الرانفور الجانبي، جزيئات ربط الحديد التي تنتجها البكتيريا، حفز نمو العديد من العزلات الفموية الجديدة. Pyoverdines، وهو نوع من siderophore التي تنتجها الأنواعالزائفة، وتبين أن تسهل بشكل كبير نمو نوع بريفوتيلا رواية7. في نفس الدراسة، تمت زراعة أول عزل عن طريق الفم لكلوروفليكسي فيلوم، وأيضا باستخدام نواة F. كمساعد لتوفير بعض المجمع غير معروف حتى الآن7. في الآونة الأخيرة ، تم عزل بكتيريا من جنس Ruminococcaceae باستخدام البكتيريا fragilis ككائن مساعد8. وتبين في وقت لاحق أن حمض غاما أمينوبوتيريك (GABA), ناقل عصبي مثبط, كان مطلوبا للنمو على وسائل الإعلام المختبرية. وقد ثبت أن استخدام الكائنات المغذية استراتيجية رئيسية لمحاكاة بيئة دقيقة محددة تنمو فيها البكتيريا غير المستزرعة، كونها أكثر كفاءة من إعادة صياغة وسائط النمو باستمرار مع إضافات مختلفة بتركيزات متفاوتة.
واحدة من أكبر مجموعات البكتيريا غير المستثناة هي في “مرشح فيلة الإشعاع” (CPR)، وهي مجموعة أحادية من عدة مرشح البكتيريا فيلا9،10. حتى كتابة هذه السطور، تم بنجاح استزراع أعضاء فيلوم Saccharibacteria داخل الإنعاش القلبي الرئوي بنجاح في المختبر. عزل الأول،‘Nanosynbacter lyticus’ سلالة TM7x، تم عزل باستخدام streptomycin المضادات الحيوية، والتي كان من المتوقع أن تثري ل TM7 غير مثقف11،12. وكان الاكتشاف الرئيسي لهذا العمل هو أن العزل الجديد نما كطفيلي ينمو في اتصال مباشر مع مضيف بكتيري ، Schaalia odontolytica، وأظهر المجهر أن هذه الطفيليات كانت بكتيريا فائقة النحافة.
باستخدام هذه القرائن، ابتكرنا طريقة لإنشاء بسرعة الثقافات الثنائية المشتركة من Saccharibacteria مع شركائها عن طريق تصفية لوحة الأسنان والعينات الفموية الأخرى من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر، وجمع الخلايا في الخيوط عن طريق الطرد المركزي واستخدامها لإصابة ثقافات البكتيريا المضيفة المرشحة. ولهذه الطريقة ميزة تجنب ثقافات الإثراء، التي يمكن أن تطغى عليها الكائنات الحية سريعة النمو. كما أنه يتجنب استخدام المضادات الحيوية، التي يمكن أن توقف نمو أنواع الساكاريكتيريا المستهدفة أو مضيفيهم. باستخدام الطريقة التي أظهرت هنا، قمنا بنجاح زراعة 32 عزلة من فيلوم Saccharibacteria.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند أسلوبنا في تصفية البلاك وتطبيقه على الثقافات النقية للكائنات المضيفة إلى حد كبير على الملاحظات السابقة على أول Saccharibacteria المستزرعة ،‘Nanosynbacter lyticus’ سلالة TM7x11،14،15. وبالنظر إلى صغر حجم الخلية، استنتجنا أنه يمكن فصلها عن لوحة الأسنان باستخدام فلتر وتركيزها مع الطرد المركزي. ثانيا، بما أن هذه الكائنات الحية تعيش كطفيليات، فإن توفير هذه الخلايا ثقافات نقية للمضيفين سيسمح لها بالدخول في تكافل والنمو كثقافات ثنائية.
وإحدى مزايا هذه الطريقة هي أنها لا تتطلب ثقافة تخصيب أو ضغطا انتقائيا. ‘Nanosynbacter lyticus’ سلالة TM7x كانت مثقفة من ثقافة الإثراء باستخدام streptomycin كعامل انتقائي، والتي التسلسل قد اقترح أن تكون فعالة في إثراء لSaccharibacteria. ومن قبيل الصدفة، المضيف ل‘نانوسنباكتر lyticus’ Schaalia odontolytica، ومن المعروف أن تكون مقاومة لstreptomycin16. كما أن استخدام المضادات الحيوية كعامل انتقائي يمكن أن يمنع الكائن المضيف من النمو، الأمر الذي بدوره سيحول دون نمو البكتيريا الساكاريباكتيرية.
ومن القضايا الأكبر المتعلقة باستخدام ثقافات الإثراء أن الكائنات الحية سريعة النمو ستشرد بسرعة الكائنات الحية ذات الأهمية. في تجويف الفم ، على سبيل المثال ، يمكن أن تنمو أنواع المكورات العقدية بسرعة ، وإذا كان السكر موجودا في وسط النمو ، فإنها تنتج ما يكفي من الحمض لتحمض الوسط ، مما يزيد من الاختيار ضد الكائنات الحية ذات الاهتمام. من خلال تجنب ثقافة التخصيب والمضادات الحيوية الانتقائية ، توفر طريقتنا نهجا عاما يمكن تطبيقه على مجموعة أوسع من Saccharibacteria والمضيفين المحتملين دون مضاعفات هذه الطرق الأخرى.
هناك بعض العقبات التي تعترض الطريقة المعروضة هنا. أولا، تفترض هذه الطريقة أن Saccharibacteria يعيش في ثقافة ثنائية. لم نختبر مجموعات من الثقافات الثلاثية أو الترنية لقياس فعاليتها ، ولكن هناك على الأرجح Saccharibacteria التي تتطلب عوامل نمو لا يمكن للكائن المضيف الوحيد توفيرها. اختبار مجموعات واسعة من البكتيريا عن طريق الفم التي يمكن أن تدعم نمو Saccharibacteria سيكون مهمة شاقة. ثانيا، تفترض الطريقة أن جميع البكتيريا الساكارية صغيرة بما يكفي لتمريرها من خلال فلتر 0.2 ميكرومتر. يمكن أن يكون أن Saccharibacteria أخرى أكبر مما يعتقد والمرشح هو اختيار ضد هذه الكائنات الحية. يمكن استخدام فلتر بحجم مسام أكبر ، ولكن هذا ينطوي على خطر السماح بمزيد من البكتيريا الفموية غير المرغوب فيها في الثقافة المشتركة المصابة. وأخيرا، من الصعب جدا العثور على الأنواع المضيفة خارج تلك التي تم نشرها بالفعل. حتى الآن ، فإن المضيفين الناجحين الوحيدين هم الأنواع من جنس Actinomyces ، Schaalia ، Arachnia وSsيلوزيميروبيوم، وجميع أعضاء أكتينوباكتيرياphylum 15،17،18. ومع ذلك ، فإن هؤلاء المضيفين يدعمون فقط نمو Saccharibacteria محددة. زراعة المزيد من أنواع Saccharibacteria، يجب استكشاف العديد من المضيفين.
نأمل أن تساعد الطريقة المعروضة هنا في الأبحاث المستقبلية ل Saccharibacteria وغيرها من الكائنات الحية في الإنعاش القلبي الرئوي. التسلسل الميتاجنومي يشير إلى أن هذه الكائنات الحية لديها أيضا الجينوم الصغيرة ويشتبه في أن تكون symbionts أو الاعتماد على المجتمع الميكروبي المحلي لتوريد الأيض وغيرها من العوامل الحاسمة لبقائها19. ويمكن استخدام استراتيجية تصفية مماثلة لعزل هذه الكائنات، شريطة أن تكون صغيرة بما فيه الكفاية وأن الكائنات (الكائنات) المضيفة لها يمكن استزراعها. الطرق الموصوفة هنا هي خطوة أولى لجلب الأدوات القوية للثقافة المختبرية إلى هذه المجموعة الكبيرة والمتنوعة من البكتيريا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا آن تانر وبروس باستر وهيكي بويسفيرت وشيويسونغ هي وباتبيليغ بور على المناقشات المفيدة وعلى توفير السلالات البكتيرية. نشكر سوزان يوست وجيسيكا وودز على المساعدة التقنية الميكروبية. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والوجه القحفي للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز R37 DE016937 (FED) وR01 DE024468 (FED) و T32 DE007327 (AJC). المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
| Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
| Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
| MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
| Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
| O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
| Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
| P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
| P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
| P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
| P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
| P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
| PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
| PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
| Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
| Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
| Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
| Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
| Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
| SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
| Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
| Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
| Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
| Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |
References
- Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012 (2011).
- Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).
- Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).
- Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).
- Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
- Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of ‘unculturable’ oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).
- Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
- Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).
- Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
- He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
- Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
- Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
- Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
- Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
- Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
- Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).
- Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
- Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).
