JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Het vestigen van stabiele binaire culturen van symbiotische saccharibacteriën uit de mondholte

Published: April 13, 2021
doi:
10.3791/62484
, ,
1The Forsyth Institute, 2Harvard School of Dental Medicine

Summary

We demonstreren een methode voor het isoleren van moeilijk te kweken leden van de nieuwe bacteriële fylum, Saccharibacteriën, door tandplak te filteren en samen te kweken met gastheerbacteriën.

Abstract

Veel bacteriële soorten kunnen niet in het laboratorium worden gekweekt met behulp van standaardmethoden, wat een aanzienlijke barrière vormt voor het bestuderen van de meerderheid van microbiële diversiteit op aarde. Nieuwe benaderingen zijn nodig om deze niet-gekweekte bacteriën te gekweekt, zodat onderzoekers hun fysiologie en levensstijl effectief kunnen bestuderen met behulp van de krachtige tools die beschikbaar zijn in het laboratorium. De Candidate Phyla Radiation (CPR) is een van de grootste groepen ongecultiveerde bacteriën, die ~15% van de levende diversiteit op aarde omvat. Het eerste isolaat van deze groep was een lid van de Saccharibacteria phylum, ‘Nanosynbacter lyticus‘ stam TM7x. TM7x is een ongewoon kleine bacterie die leeft als een symbiont in direct contact met een bacteriële gastheer, Schaalia odontolytica, stam XH001. Gebruikmakend van de ongewoon kleine celgrootte en zijn levensstijl als symbiotisch organisme, ontwikkelden we een protocol om Saccharibacteriën snel te kweken uit tandplak. Dit protocol laat zien hoe u een suspensie van tandplak door een 0,2 μm-filter kunt filteren, vervolgens de verzamelde Saccharibacteriëncellen kunt concentreren en een cultuur van gastheerorganismen kunt infecteren. De resulterende cocultuur kan worden doorgepasseerd als elke normale bacteriële cultuur en infectie wordt bevestigd door PCR. De resulterende binaire cultuur kan in het laboratorium worden gehandhaafd en worden gebruikt voor toekomstige experimenten. Hoewel besmetting een mogelijkheid is, kan de binaire cultuur worden gezuiverd door ofwel verdere filtering en herinfectie van gastheer, of door plating van de binaire cultuur en screening op geïnfecteerde kolonies. We hopen dat dit protocol kan worden uitgebreid naar andere monstertypen en omgevingen, wat leidt tot de teelt van veel meer soorten in de reanimatie.

Introduction

Het cultiveren van nieuwe soorten bacteriën en ze in het laboratorium brengen, maakt krachtige experimenten mogelijk om hun fysiologie en bredere interacties binnen hun microbiële gemeenschap beter te begrijpen. Hoewel er cultuurvrije methoden zijn om deze vragen te ondervragen (bijv. “meta-omics”), maken de complexe interacties van verschillende microbiële populaties het moeilijk om afzonderlijke variabelen uit elkaar te plagen en zinvolle conclusies te trekken. Hoewel het kweken van bacteriën veel voordelen heeft, zijn er veel potentiële barrières om een bacterie te isoleren en in pure cultuur te kweken. Mogelijke specifieke groeivereisten zijn pH, zuurstofspanning, vitamines, groeifactoren, signaalmoleculen of zelfs direct celcontact om groei op te wekken1. Er wordt echter aangenomen dat specifieke auxotrofieën het primaire afschrikmiddel zijn voor het cultiveren van nieuwe soorten bacteriën. Standaard mediaformuleringen missen veel voedingsstoffen die nodig zijn voor ongecultiveerde bacteriën, zoals specifieke vitamines of koolstofbronnen. Deze ontbrekende moleculen kunnen de sleutel zijn tot de fysiologie van de niet-gecultiveerde bacteriën en worden meestal geleverd door een ander organisme in de microbiële gemeenschap of een gastheerorganisme. Complexe koolhydraten zoals mucines kunnen bijvoorbeeld worden geleverd door gastheren van dieren. Door deze toe te voegen aan media zijn verschillende bacteriën uit dierlijke darmen kunnen worden gekweekt, waaronder Akkermansia muciniphila en Mucinivorans hirudinis2,3,4. Veel pathogene bacteriën hebben het vermogen ontwikkeld om ijzer gebonden aan hemine te gebruiken in dierlijke cellen, waaronder de orale ziekteverwekker Porphyromonas gingivalis5. In het laboratorium kan de groei van Porphyromonas en andere organismen worden gestimuleerd door de toevoeging van hemine6.

Onlangs zijn veel doorbraken in het cultiveren van nieuwe isolaten van bacteriën door co-cultivering gekomen, met behulp van een “feeder” organisme om specifieke factoren te bieden aan niet-gecultiveerde bacteriën die nodig zijn voor hun groei. Een elegante studie van Vartoukian en collega’s toonde aan dat siderophores, ijzerbindende moleculen geproduceerd door bacteriën, de groei van verschillende nieuwe orale isolaten stimuleerden. Pyoverdines , een soort siderophore geproduceerd door pseudomonad-soorten, bleken de groei van een nieuwe Prevotella-soort aanzienlijk te vergemakkelijken7. In dezelfde studie werd het eerste orale isolaat voor de fylum Chloroflexi gekweekt, waarbij ook F. nucleatum werd gebruikt als een helper voor het leveren van een nog onbekende verbinding7. Meer recent werd een bacterie uit het geslacht Ruminococcaceae geïsoleerd met behulp van Bacteroides fragilis als helperorganisme8. Later werd aangetoond dat gamma aminoboterzuur (GABA), een remmende neurotransmitter, nodig was voor de groei op laboratoriummedia. Het gebruik van feederorganismen is een belangrijke strategie gebleken om specifieke micromilieus na te bootsen waar niet-gecultiveerde bacteriën groeien, efficiënter dan het voortdurend herformuleren van groeimedia met verschillende additieven in verschillende concentraties.

Een van de grootste groepen ongekweekte bacteriën bevindt zich in de “Candidate Phyla Radiation” (CPR), een monofyletische groep van verschillende kandidaat-bacteriële phyla9,10. Op dit moment zijn alleen leden van de Saccharibacteria phylum binnen de CPR met succes gekweekt in het laboratorium. Het eerste isolaat, ‘Nanosynbacter lyticus’ stam TM7x, werd geïsoleerd met behulp van het antibioticum streptomycine, waarvan was voorspeld dat het zou verrijken voor de ongekweekte TM711,12. Een belangrijke ontdekking van dit werk was dat het nieuwe isolaat groeide als een parasiet die in direct contact groeide met een bacteriële gastheer, Schaalia odontolytica, en microscopie toonde aan dat deze parasieten ultrasmall bacteriën waren.

Met behulp van deze aanwijzingen bedachten we een methode om snel binaire coculturen van Saccharibacteriën met hun partners vast te stellen door tandplak en andere orale monsters te filteren via een filter van 0,2 μm, cellen in het filtraat te verzamelen door centrifugeren en ze te gebruiken om culturen van kandidaat-gastheerbacteriën te infecteren. Deze methode heeft het voordeel dat verrijkingsculturen worden vermeden, die kunnen worden overweldigd door snelgroeiende organismen. Het vermijdt ook het gebruik van antibiotica, die de groei van de beoogde Saccharibacteriën-soorten of hun gastheren kunnen stoppen. Met behulp van de hier gedemonstreerde methode hebben we met succes 32 isolaten gekweekt uit de Saccharibacteria phylum.

Protocol

Bij de ontwikkeling van dit protocol werd IRB-goedkeuring gevraagd en goedgekeurd (#14-10) en werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen. 1. Voorbereiding Bij het werken met menselijke proefpersonen moet u de nodige IRB-goedkeuring en geïnformeerde toestemming verkrijgen. Start culturen van gastheerbacteriën met voldoende tijd om door te groeien naar de vroege stationaire fase. Inenteer bijvoorbeeld 2-5 ml tryptische sojabouillon met 0,1% gistextract toegevoegd (TSBY) met Arachnia propionica en incubeer bij 37 °C gedurende 24 uur. Monteer filterhouders met track-geëtst 0,2 μm filtermembraan. Wikkel de assemblage in folie en steriliseer door autoclaaf. Steriliseer centrifugebuizen en dopassemblages. 2. Verkrijg monster van orale bacteriën OPMERKING: Hoewel veel orale monsters Saccharibacteriën bevatten (bijv. speeksel, uitstrijkjes van amandelen, tongschrapen), is tandplak routinematig het meest succesvol. Neem een plakschrapen met behulp van een steriel papierpunt, Gracey curette, of, indien zelfbemonstering, gebruik een steriele tandenstoker of pipettip. Breng plaque over naar een geschikte buffer, zoals maximaal herstelverduisteringswater (MRD, 0,85% NaCl, 0,1% pepton) of PBS. Als het monster niet onmiddellijk wordt verwerkt, houdt u het op ijs totdat het klaar is om verder te gaan. Resuspend de tandplak krachtig in MRD buffer met behulp van een combinatie van vortexing en pipetten met een kleine pipet tip. Voeg opnieuw gesuspendeerd plaquemonster toe aan nog eens 9 ml MRD-buffer. 3. Filtraat bereiden uit oraal monster Pak met behulp van aseptische techniek een steriele filtereenheid uit. Draai een kwartslag los en draai de filterhouder weer vast om er zeker van te zijn dat de draden goed zijn vastgehouden en het apparaat goed is gesloten. Was het membraan met een spuit door 10 ml MRD-buffer door het apparaat te laten gaan. Onjuiste montage wordt bij deze stap aan het licht gekomen door vloeistof die uit de filterhouder lekt. Als er lekkage optreedt, verkrijg dan een andere steriele filtereenheid en herhaal de wasstap. Breng het monster aan op het gewassen filter. Verwijder de zuiger uit een spuit en bevestig deze aan het filterapparaat. Giet het gedispergeerde tandmonster, nu in 10 ml MRD-buffer, in een spuit en laad het op het filter. Plaats een steriele centrifugebuis onder het filterapparaat om het filtraat op te vangen en oefen vervolgens lichte druk uit op de zuiger om het monster door het filter te duwen. Herhaal de procedure met nog eens 10 ml MRD-buffer om het membraan te wassen en verzamel de doorstroming in dezelfde buis als het gefilterde monster. Sluit de buis aseptisch af. 4. Concentraat Saccharibacteriën cellen door centrifugeren Maak een oriëntatiemarkering op de buis en dop en plaats de buis in een hogesnelheidscentrifuge met de markering aan de bovenkant. De pellet gevormd uit centrifugeren is meestal onzichtbaar. De markering zal helpen bepalen waar de pellet van Saccharibacteriëncellen zich bevindt wanneer centrifugeren wordt uitgevoerd en de buis uit de centrifuge wordt verwijderd. Centrifugeer de monsters bij 60.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.OPMERKING: Deze kracht en tijd is voldoende om alle Saccharibacteriëncellen te pelleteren. Saccharibacteriëncellen kunnen echter ten minste gedeeltelijk worden geplet door centrifugeren gedurende slechts 20 minuten bij 20.000 x g. Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge. Giet de vloeistof uit de buis en houd de pellet aan de bovenkant van de buis. Resuspendeer de gewoonlijk onzichtbare pellet in 1-2 ml MRD-buffer door krachtige vortexing. 5. Infecteer gastheerculturen met saccharibacteriënverrijkt filtraat Bereid kweekbuizen voor door 2 ml geschikte groeimedia (bijv. TSBY, BHI, enz.) in buizen te gieten. Voeg 200 μL overnight kweek van gastheerorganismen toe aan elke buis. Voeg 100-200 μL geresuspendeerd, gefilterd monster toe aan elke buis. Incubeer gecombineerde monsters naar gelang van het geval voor het gastheerorganisme (bv. 37 °C, in een aerobe atmosfeer voor A. propionica). Door voer de cellen om de twee tot drie dagen door 200 μL binaire cultuur over te brengen naar 2 ml vers groeimedium in een nieuwe buis. Als blijkt dat de doorgepasseerde culturen geen groei vertonen (d.w.z. de troebelheid / optische dichtheid van de cultuur neemt niet toe na passage in verse media) kan de Saccharibacteriën overweldigend zijn of het hele gastheerorganisme doden. Om dit te verhelpen, voegt u 200 μL niet-geïnfecteerde gastheercultuur toe bij het passeren van de cellen. Herhaal dit gedurende ten minste 5 passages. 6. Bevestig infectie door PCR Bevestig na 5 passages de infectie met PCR. Vijf passages zullen ervoor zorgen dat niet-groeiende Saccharibacteriën cellen zijn uitgeput boven de detectielimiet met behulp van 25 cycli PCR. Bereid een PCR mastermix voor. Een voorgesteld recept voor elke benodigde buis is 12,5 μL 2x PCR buffer, 0,75 μL10 μM Forward primer (580F 12 – AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0,75 μL10μM Reverse primer (1177R 13 – GAC CTG ACA TCA TCC) Mix door vortexen. Aliquot 24 μL mastermix in een PCR-buis van 0,2 ml. Voeg 1 μL met Saccharibacteriën geïnfecteerde cultuur toe aan de PCR-reactie. Plaats de buis in een thermocycler en voer het volgende protocol uit: Initiële denaturatie 95 °C gedurende 5 min, 25 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C voor 30 s, 72 °C voor 30 s, laatste verlenging bij 72 °C gedurende 2 min, dan laatste greep bij 4 °C. Laad en voer de PCR-producten uit in een 1% agarose gel. Een band van ~600 bases geeft de aanwezigheid van Saccharibacteriën aan. 7. Controleer op zuiverheid en verwijder besmette organismen Bevestig de zuiverheid van positieve culturen door de cocultuur van Saccharibacteriën te plateren op nutriëntenagar die voldoende is voor de groei van het gastheerorganisme. Voer een 10-voudige seriële verdunning van de kweek uit in steriele buffer (bijv. MRD of PBS) en verdeel 100 μL over een agarplaat. Voer verdunningen uit zodat er ongeveer 20-200 kolonies op de agarplaat groeien. Incubeer de kweek in geschikte groeiomstandigheden en observeer voor besmette organismen.OPMERKING: Axenische Saccharibacteriën kolonies zijn nooit waargenomen, dus alleen het gastheerorganisme wordt waargenomen groeiend op deze platen. Meer dan één kolonietype duidt meestal op besmetting. Als er verontreiniging optreedt, moet de cultuur opnieuw worden gefilterd om de ongewenste verontreinigingen te verwijderen en opnieuw worden ingeënt op een nieuwe gastheer. Af en toe treedt een dubbele infectie op, waarbij twee Saccharibacteriën-soorten dezelfde gastheer infecteren. Om de Saccharibacteriën te scheiden, resuspend individuele kolonies in 20 μL steriel PBS en gebruik 1 μL suspensie in een PCR-reactie om kolonies met Saccharibacteriën-infecties te detecteren. Breng de schorsingen die een positief resultaat gaven over naar groeimedium om een binaire cultuur te starten. Het slagingspercentage hangt af van de titer van elke Saccharibacteriën-soort in de cultuur. Het kan nodig zijn om meer dan 50 kolonies te screenen om een geïnfecteerde kolonie te vinden voor vermeerdering. 8. Opslag van culturen Kweek een binaire cultuur van voldoende volume (10-50 ml) ‘s nachts. Pelletcellen door centrifugeren (4.000 x g gedurende 10 min).OPMERKING: Hoge snelheid centrifugeren is hier niet nodig, omdat Saccharibacteriën cellen zullen worden bevestigd aan de grotere, zwaardere cellen van de gastheer en zal pellet met hen. Resuspend cellen in cryoprotectant. Groeimedia aangevuld met 5% DMSO of 20% glycerol is meestal voldoende. Zorg ervoor dat het gastheerorganisme compatibel is met cryoprotectant media (bijv. groei van A. propionica wordt geremd door glycerol en bevroren voorraden mogen niet herleven). Test de levensvatbaarheid van een niet-geïnfecteerde gastheercultuur met cryoprotectant om ervoor te zorgen dat bestanden het invriezen kunnen overleven. Resuspend cel pellet in hetzelfde volume van cultuur (10-50 ml). Aliquot 0,5 ml in gelabelde cryovials. Vries celculturen in bij -80 °C.

Representative Results

PCR voor detectie van Saccharibacteriën kan negatief lijken (d.w.z. geen product gezien) in initiële infectieculturen als gevolg van een laag aantal Saccharibacteriënsymbionts. Na enkele passages moet echter een sterk PCR-product verschijnen waaruit blijkt dat er een stabiele infectie is opgetreden (figuur 1A). Omgekeerd zullen sommige infecties in eerste instantie positief lijken door PCR, maar verminderen tot niet detecteerbaar na 1-4 passages (niet weergegeven). Dit geeft aan dat een grote hoeveelheid Saccharibacteriëncellen aanwezig waren in het oorspronkelijke filtraat, maar door passage werden verdund en niemand in staat was om een stabiele symbiose met de gastheercultuur aan te gaan. Het testen van verschillende gastheersoorten met hetzelfde Saccharibacteriën filtraat uit de mondholte zal meestal een laag slagingspercentage hebben (Figuur 1B) omdat de symbiont-gastheer interactie zeer specifiek is. Een onderzoeker kan dezelfde gastheer ook testen met filtraten van verschillende proefpersonen. Als een goed gastheerorganisme (zoals Arachnia propionica of Schaalia odontolytica)wordt gebruikt, kan een slagingspercentage van 50% worden verwacht. Testen door PCR is cruciaal. Ervaren onderzoekers hebben geprobeerd om infectie te bevestigen door microscopie, alleen om valse positieven te melden. De Saccharibacteriën cellen zijn klein en moeilijk te onderscheiden tussen blaasjes of onregelmatige cel envelop uitstulpingen. Een PCR-signaal stabiel door verschillende passages is de sleutel om een succesvolle infectie te bevestigen. Naarmate de geïnfecteerde culturen groeien, moet normale troebele groei verschijnen. Naarmate de symbiose zich vestigt, zullen geïnfecteerde culturen minder troebel lijken dan culturen van niet-geïnfecteerde gastheerorganismen (figuur 2A). In sommige gevallen kunnen geïnfecteerde culturen volledig stoppen met groeien en helemaal niet troebel worden. Dit kan te wijten zijn aan een infectie waarbij de Saccharibacteriëncellen het gastheerorganisme overweldigen. Het toevoegen van “verse” (niet-geïnfecteerde) gastheer aan deze culturen zou een voldoende populatie van gastheer moeten bieden om de voortdurende groei van de Saccharibacteriënparasieten te ondersteunen. Overgroei, of overmatig troebele culturen, kunnen wijzen op besmetting door een laboratoriumverontreiniging of een andere kleine orale bacterie die door het 0,2 μm-filter kon gaan. Campylobacter en Capnocytophaga spp. zijn typische orale verontreinigingen van deze experimenten. Dit kan worden bevestigd door de cultuur te plateren en op zoek te gaan naar kolonies die atypisch zijn voor het gastheerorganisme, gevolgd door 16S rRNA-sequencing. Als verontreiniging wordt waargenomen, is het filteren van deze culturen door een filter van 0,2 μm meestal voldoende om de verontreinigingen te verwijderen. Saccharibacteriëncellen in het filtraat kunnen worden geconcentreerd door centrifugeren en worden gebruikt om een zuivere gastheercultuur opnieuw te infecteren. Een andere manier om een besmette cultuur te zuiveren is door geïnfecteerde kolonies te plukken van het plateren van een geïnfecteerde cultuur. Kolonies van geïnfecteerde gastheren kunnen soms worden geïdentificeerd aan de den irreguliere kolonievorm in vergelijking met niet-geïnfecteerde kolonies (figuur 2B-D). Deze onregelmatige kolonies zijn afhankelijk van de titer van Saccharibacteriën in de binaire cultuur en een kleiner deel van de kolonies zal onregelmatig lijken als de titer laag is. Dit kan het gemakkelijk maken om geïnfecteerde kolonies te identificeren, die kunnen worden geplukt en gebruikt om een pure binaire cultuur te starten. Als er geen onregelmatige kolonies worden gezien op plating van een met Saccharibacteriën geïnfecteerde cultuur, is het mogelijk dat de symbiont zich op een laag titer bevindt of geen onregelmatig gevormde kolonies veroorzaakt. In een dergelijk geval kunnen PCR-screeningkolonies met een normaal uiterlijk infectie door Saccharibacteriën vertonen, maar in een laag tempo (2-10% van alle kolonies). Figuur 1: Typische PCR-resultaten van Saccharibacteriën-infecties van gastheerculturen. (A) Een PCR-product dat de aanwezigheid van Saccharibacteriën aangeeft, verschijnt mogelijk niet bij de eerste infectie, maar kan in latere passages verschijnen en sterker worden naarmate de cocultuur zich vestigt. (B) De meeste gastheren die besmet zijn met saccharibacteriënverrijkt filtraat zullen hun groei niet ondersteunen vanwege de specificiteit van de symbiose. In dit voorbeeld werd alleen A. propionica met succes geïnfecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 2: Groeikenmerken van met Saccharibacteriën geïnfecteerde culturen. (A) Groeicurven van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde culturen van A. propionica die geïnfecteerde culturen vertonen, zullen niet tot dezelfde dichtheid groeien als de niet-geïnfecteerde controle en lijken minder troebel. (B-D) Plating van coculturen kan onregelmatige kolonies produceren, veroorzaakt door Saccharibateria-infecties. Onregelmatige kolonies zullen in verhouding afnemen ten opzichte van de titer van Saccharibacteriën in de cocultuur. (B) Gastheer met een hoog niveau van Saccharibacteriën. (C) 10-voudig verdunde Saccharibacteriën (D) Niet-geïnfecteerde gastheercultuur. Witte pijlen geven voorbeelden van onregelmatige kolonies aan. Schaalbalk= 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Onze methode om plaque te filteren en toe te passen op zuivere culturen van gastheerorganismen is grotendeels gebaseerd op eerdere waarnemingen over de eerste gekweekte Saccharibacteriën, ‘Nanosynbacter lyticus’ stam TM7x11,14,15. Gezien de kleine celgrootte, concludeerden we dat ze konden worden gescheiden van tandplak met behulp van een filter en geconcentreerd met centrifugeren. Ten tweede, aangezien deze organismen leven als parasieten, zou het verstrekken van deze cellen zuivere culturen van gastheren hen in staat stellen om in een symbiose te komen en te groeien als binaire culturen.

Een voordeel van deze methode is dat het geen verrijkingscultuur of selectieve druk vereist. ‘ Nanosynbacter lyticus’ stam TM7x werd gekweekt uit een verrijkingscultuur met streptomycine als selectief middel, waarvan sequencing had gesuggereerd dat het effectief zou zijn in het verrijken van Saccharibacteriën. Toevallig is bekend dat de gastheer voor ‘Nanosynbacter lyticus’ Schaalia odontolytica, resistent is tegen streptomycine16. Het gebruik van antibiotica als selectief middel zou ook kunnen voorkomen dat het gastheerorganisme groeit, wat op zijn beurt de groei van Saccharibacteriën zou uitsluiten.

Een groter probleem van het gebruik van verrijkingsculturen is dat snelgroeiende organismen organismen die van belang zijn snel zullen verdringen. In de mondholte kunnen streptokokkensoorten bijvoorbeeld snel groeien en, als er suiker in het groeimedium aanwezig is, voldoende zuur produceren om het medium te verzuren, verder selecteren tegen organismen van belang. Door een verrijkingscultuur en selectieve antibiotica te vermijden, biedt onze methode een algemene aanpak die kan worden toegepast op een breder scala aan Saccharibacteriën en potentiële gastheren zonder de complicaties van deze andere methoden.

Er zijn enkele obstakels voor de hier gepresenteerde methode. Ten eerste gaat deze methode ervan uit dat Saccharibacteriën in een binaire cultuur leven. We hebben geen combinaties van trinaire of ternaire culturen getest om hun effectiviteit te meten, maar er zijn waarschijnlijk Saccharibacteriën die groeifactoren vereisen die een enkel gastheerorganisme niet kan leveren. Het testen van de enorme combinaties van orale bacteriën die de groei van Saccharibacteriën zouden kunnen ondersteunen, zou een ontmoedigende taak zijn. Ten tweede gaat de methode ervan uit dat alle Saccharibacteriën klein genoeg zijn om door een filter van 0,2 μm te gaan. Het kan zijn dat andere Saccharibacteriën groter zijn dan gedacht en het filter selecteert tegen deze organismen. Een filter met een grotere poriegrootte kan worden gebruikt, maar dit loopt het risico om meer ongewenste orale bacteriën toe te laten in de geïnfecteerde co-cultuur. Ten slotte is het erg moeilijk om gastheersoorten te vinden buiten de soorten die al zijn gepubliceerd. Tot nu toe zijn de enige succesvolle gastheren soorten uit de geslachten Actinomyces, Schaalia, Arachnia en Cellulosimicrobium, alle leden van de phylum Actinobacteria15,17,18. Deze gastheren ondersteunen echter alleen de groei van specifieke Saccharibacteriën. Om meer soorten Saccharibacteriën te gekweekt, moeten veel meer gastheren worden verkend.

We hopen dat de hier gepresenteerde methode toekomstig onderzoek naar de Saccharibacteriën en andere reanimatie-organismen zal helpen. Metagenomic sequencing suggereert dat deze organismen ook kleine genomen hebben en waarvan wordt vermoed dat ze symbionten zijn of afhankelijk zijn van de lokale microbiële gemeenschap om metabolieten en andere factoren te leveren die van cruciaal belang zijn voor hun overleving19. Een soortgelijke filterstrategie zou kunnen worden gebruikt om deze organismen te isoleren, op voorwaarde dat ze klein genoeg zijn en dat hun gastheerorganismen kunnen worden gekweekt. De hier beschreven methoden zijn een eerste stap om de krachtige instrumenten van laboratoriumcultuur naar deze grote en diverse groep bacteriën te brengen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He en Batbileg Bor bedanken voor nuttige discussies en voor het leveren van bacteriestammen. We danken Susan Yost en Jessica Woods voor microbiële technische hulp. Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) en T32 DE007327 (AJC). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.

Materials

Agarose Fisher Scientific BP160-100
Alphaimager Cell Biosciences FluorChem HD2 Or equivalent UV gel imaging system
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-101
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) Becton-Dickinson 211059 Or other growth media suitable for target organisms
Centrifuge Rotor 70-Ti Beckman Coulter 337922
Cryovials Fisher Scientific 12-567-500
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Electrophoresis Power Supply Bio-Rad 1645052
Electrophoresis Rig Bio-Rad 1704467
Filter Forceps Millipore Sigma XX6200006P Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling
Glycerol Fisher Scientific G33-500
GoTaq Green Mastermix Promega M7122
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf 950040025 Or equivalent thermocycler for PCR
MgCl2 solution 25mM Promega A3513
Molecular Biology grade water Fisher Scientific BP2819100
O2 Control InVitro Glove Box Coy Laoratories 031615 If needed for microaerobic organisms
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge Beckman Coulter 8043-30-1124
P-10 micro pipette Gilson F144802
P-1000 micro pipette Gilson F123601G
P-2 micro pipette Gilson F144801
P-20 micro pipette Gilson F123600
P-200 micro pipette Gilson F123602G
PBS Fisher Scientific BP399500
PCR tubes 0.2 mL Fisher Scientific 14-230-205
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Pipette tips – 10 μL Fisher Scientific 02-717-157
Pipette tips – 1000 μL Fisher Scientific 02-717-166
Pipette tips – 20 μL Fisher Scientific 02-717-161
Pipette tips – 200 μL Fisher Scientific 02-717-165
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size Millipore GTTP04700
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL Falcon 352096 Or other tube suitable for bacterial culture
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-1
Swin-Lok Filter  – 47mm Whatman 4200400
SYBR Safe DNA Gel stain ThermoFisher Scientific S33102
Syringes – 20 mL Fisher Scientific 14-955-460
TAE Buffer (50x) concentrate Fisher Scientific P1332500
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps Beckman Coulter 355618
Tryptic Soy Blood Agar Plates Northeast Laboratory Services P1100 Or other agar plate sufficient for growth of host organisms
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) Becton-Dickinson 211825 Or other growth media suitable for target organisms
Vinyl Anaerobic Chamber Coy Laboratories 032714 If needed for anaerobic organisms
Vortex mixer Scientific Industries SI-0236
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. Journal of Bacteriology. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  2. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), 00012 (2011).
  3. Derrien, M., Vaughan, E. E., Plugge, C. M., de Vos, W. M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54, 1469-1476 (2004).
  4. Nelson, M. C., Bomar, L., Maltz, M., Graf, J. Mucinivorans hirudinis gen. nov., sp. nov., an anaerobic, mucin-degrading bacterium isolated from the digestive tract of the medicinal leech Hirudo verbana. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 990-995 (2015).
  5. Scott, J. C., Klein, B. A., Duran-Pinedo, A., Hu, L., Duncan, M. J. A two-component system regulates hemin acquisition in porphyromonas gingivalis. PLoS One. 8 (9), 0073351 (2013).
  6. Martin, B., et al. New growth media for oral bacteria. Journal of Microbiological Methods. 153 (22), 10-13 (2018).
  7. Vartoukian, S. R., et al. In vitro cultivation of ‘unculturable’ oral bacteria, facilitated by community culture and media supplementation with siderophores. Plos One. 11 (1), 0146926 (2016).
  8. Strandwitz, P., et al. GABA-modulating bacteria of the human gut microbiota. Nature Microbiology. 4 (3), 396-403 (2019).
  9. Hug, L. A., et al. A new view of the tree of life. Nature Microbiology. 1, 16048 (2016).
  10. Castelle, C. J., Banfield, J. F. Major new microbial groups expand diversity and alter our understanding of the tree of life. Cell. 172 (6), 1181-1197 (2018).
  11. He, X., et al. Cultivation of a human-associated TM7 phylotype reveals a reduced genome and epibiotic parasitic lifestyle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 244-249 (2015).
  12. Hugenholtz, P., Tyson, G., Webb, R. I., Wagner, A. M., Blackall, L. L. Investigation of candidate division TM7, a recently recognized major lineage of the domain Bacteria with no known pure-culture representatives. Applied and Environmental Microbiology. 67 (1), 411-419 (2001).
  13. Brinig, M., Lepp, P. Prevalence of bacteria of division TM7 in human subgingival plaque and their association with disease. Applied and Environmental Microbiology. 69 (3), 1687-1694 (2003).
  14. Bor, B., et al. Insights obtained by culturing saccharibacteria with their bacterial hosts. Journal of Dental Research. , 689-694 (2020).
  15. Bor, B., et al. Phenotypic and physiological characterization of the epibiotic interaction between TM7x and its basibiont actinomyces. Microbial Ecology. 71 (1), 243-255 (2016).
  16. Skopek, R. J., Liljemark, W. F., Bloomquist, C. G., Rudney, J. D. Dental plaque development on defined streptococcal surfaces. Oral Microbiology and Immunology. 8 (1), 16-23 (1993).
  17. Murugkar, P. P., Collins, A. J., Chen, T., Dewhirst, F. E. Isolation and cultivation of candidate phyla radiation Saccharibacteria (TM7) bacteria in coculture with bacterial hosts. Journal of Oral Microbiology. 12 (1), 1814666 (2020).
  18. Cross, K. L., et al. Targeted isolation and cultivation of uncultivated bacteria by reverse genomics. Nature Biotechnology. 37 (11), 1314-1321 (2019).
  19. Kantor, R., et al. Small genomes and sparse metabolisms of sediment-associated bacteria from four candidate phyla. MBio. 4 (5), 00708-00713 (2013).

Tags

SaccharibacteriaOral CavityBinary Co-cultureObligate ParasitesHost BacteriaArachnia PropionicaDental PlaqueFiltrationIsolationMicrobiological Techniques

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Collins, A. J., Murugkar, P. P., Dewhirst, F. E. Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity. J. Vis. Exp. (170), e62484, doi:10.3791/62484 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image