Microirraggiamento laser per studiare il reclutamento del DNA durante la fase S
Summary
Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare in modo efficiente le cellule in fase S per studi di microscopia a valle, come la misurazione del reclutamento di proteine di riparazione del DNA mediante microirraggiamento laser.
Abstract
La riparazione del danno al DNA mantiene l’integrità genetica delle cellule in un ambiente altamente reattivo. Le cellule possono accumulare vari tipi di danni al DNA a causa di fonti sia endogene che esogene come attività metaboliche o radiazioni UV. Senza la riparazione del DNA, il codice genetico della cellula viene compromesso, minando le strutture e le funzioni delle proteine e potenzialmente causando malattie.
Comprendere le dinamiche spaziotemporali dei diversi percorsi di riparazione del DNA in varie fasi del ciclo cellulare è cruciale nel campo della riparazione del danno al DNA. Le attuali tecniche di microscopia fluorescente forniscono ottimi strumenti per misurare la cinetica di reclutamento di diverse proteine di riparazione dopo l’induzione del danno al DNA. La sintesi del DNA durante la fase S del ciclo cellulare è un punto peculiare nel destino cellulare per quanto riguarda la riparazione del DNA. Fornisce una finestra unica per schermare l’intero genoma alla ricerca di errori. Allo stesso tempo, gli errori di sintesi del DNA rappresentano anche una minaccia per l’integrità del DNA che non si incontra nelle cellule che non si dividono. Pertanto, i processi di riparazione del DNA differiscono significativamente nella fase S rispetto ad altre fasi del ciclo cellulare e tali differenze sono poco comprese.
Il seguente protocollo descrive la preparazione di linee cellulari e la misurazione della dinamica delle proteine di riparazione del DNA in fase S in siti di danno al DNA indotti localmente, utilizzando un microscopio confocale a scansione laser dotato di una linea laser a 405 nm. Tagged PCNA (con mPlum) è usato come marcatore del ciclo cellulare combinato con una proteina di riparazione di interesse marcata AcGFP (cioè EXO1b) per misurare il reclutamento del danno al DNA in fase S.
Introduction
Diversi percorsi di riparazione del DNA si sono evoluti per affrontare i diversi tipi di lesioni del DNA che possono insorgere nelle cellule, che sono tutte altamente regolate sia nello spazio che nel tempo. Uno dei periodi più vulnerabili del ciclo cellulare è la fase S, quando avviene la sintesi del DNA. Mentre la proliferazione è fondamentale per la vita, fornisce anche una grande sfida. Le cellule devono garantire una replica fedele del loro genoma per evitare che le mutazioni vengano trasmesse alle generazioni future. Di conseguenza, la proliferazione fornisce un punto di intervento terapeutico che è stato impiegato per lo sviluppo di approcci terapeutici nel campo dell’oncologia.
Tutte le principali tecniche utilizzate per studiare il reclutamento proteico nelle lesioni del DNA hanno i loro punti di forza e limiti. La microirraggiamento ha una migliore risoluzione spaziale e temporale1 rispetto alla maggior parte dei metodi alternativi come l’imaging immunofluorescente di focolai indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF), la cromatina-immunoprecipitazione (ChIP) o il frazionamento biochimico. Tuttavia, la micro-irradiazione la robustezza delle tecniche di cui sopra che possono campionare un gran numero di cellule contemporaneamente.
Per studiare la riparazione del DNA in fase S, si deve essere in grado di distinguere le cellule della fase S in una popolazione asincrona di coltura cellulare. Esistono molti metodi ben noti per affrontare questo problema, che coinvolgono la sincronizzazione delle cellule o la visualizzazione delle diverse fasi del ciclo cellulare. Tuttavia, entrambi gli approcci introducono sfide significative e possibili artefatti. I metodi di sincronizzazione chimica ampiamente utilizzati per arricchire le cellule nella fase S iniziale (ad esempio, doppio blocco di timidina, aphidicolin e trattamento con idrossiurea) ottengono la sincronizzazione attraverso l’induzione dello stress di replicazione e alla fine del danno al DNA stesso. Ciò limita l’uso di questi metodi per studiare i processi di riparazione del DNA nella fase S2. La sincronizzazione attraverso la fame e il rilascio di siero è applicabile solo a un numero limitato di linee cellulari, in gran parte escluse le linee cellulari tumorali che si basano meno sui fattori di crescita per la progressione del ciclo cellulare rispetto alle linee cellulari non trasformate. Il sistema FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator) è uno strumento particolarmente utile per studiare il ciclo cellulare, ma ha un limite fondamentale quando si differenzia tra le fasi del ciclo cellulare S e G23.
Qui è dimostrato che l’uso di PCNA con tag fluorescenti come marcatore non invasivo per la fase S limita gli svantaggi dei metodi di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, consentendo al contempo una maggiore specificità e flessibilità rispetto al sistema FUCCI. Come singolo marcatore, non solo il PCNA può evidenziare le cellule della fase S in una popolazione asincrona, ma può anche mostrare l’esatta progressione delle cellule all’interno della fase S(cioèfase S iniziale, media o tardiva) 4 . Bassi livelli di espressione di PCNA esogeno e marcato assicurano interferenze minime sia con la progressione del ciclo cellulare che con i processi di riparazione del DNA. È importante sottolineare che il PCNA funge anche da controllo interno per una corretta induzione del danno al DNA in quanto è coinvolto nella riparazione di diverse lesioni del DNA e viene reclutato nei siti di danno al DNA indotti localmente1,4.
Gli esperimenti qui presentati dimostrano come misurare le dinamiche di reclutamento di EXO1b in fase S e come questo è influenzato dal consolidato inibitore PARP, olaparib. L’attività della nucleasi EXO1b è rilevante per una vasta gamma di percorsi di riparazione del DNA, tra cui la riparazione del mismatch (MMR), la riparazione dell’escissione nucleotidica (NER) e la riparazione della rottura a doppio filamento (DSB). Nella fase S, EXO1b svolge un ruolo importante nella ricombinazione omologa (HR) attraverso la formazione di sporgenze di 3′ ssDNA durante la resezione del DNA5. EXO1b è stato ulteriormente implicato nella replicazione del DNA con ruoli nell’attivazione del checkpoint per riavviare le forchette del DNA in stallo, nonché nella rimozione del primer e nella maturazione del frammento di Okazaki nel filamento in ritardo durante lo spostamento del filamento nella replicazione5. Il reclutamento di EXO1b in siti di DNA danneggiati è regolato dall’interazione diretta con il poli (ADP-ribosio) (PAR)6,7. A causa delle numerose implicazioni specifiche del ciclo cellulare di EXO1b, è una scelta eccellente per gli studi di reclutamento specifici della fase S che utilizzano PCNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici e potenziali problemi/modifiche del protocollo
Un adeguato vaso di coltura tissutale per la micro-irradiazione è fondamentale per il successo. La maggior parte dei sistemi di imaging ad alta risoluzione sono ottimizzati per uno spessore del vetro di copertura di 0,17 mm. L’utilizzo di camere di imaging di spessore superiore o inferiore o di quelle realizzate con polimeri plastici (non ottimizzate per l’imaging a 405 nm) può ridurre significativamente la qualità dell’immagine. Quando si utilizzano superfici di vetro, assicurarsi che siano trattate con colture tissutali per migliorare l’adesione cellulare. Se non sono trattate con coltura tissutale, queste camere dovranno essere rivestite, ad esempio, con poli-D-lisina prima di seminare le cellule. Quando si placcano le celle nel vetro di copertura camerato, la densità cellulare ideale è fondamentale per evitare irregolarità del ciclo cellulare e stress aggiuntivo per le cellule. Un corretto equilibrio termico dei componenti del microscopio prima della sperimentazione per mantenere una temperatura stabile è fondamentale sia per mantenere la messa a fuoco durante l’imaging time lapse sia per garantire una DDR omogenea nel tempo e nei campioni.
È fondamentale che le cellule siano in condizioni sane prima della micro-irradiazione per ridurre i dati artefatti. Se le cellule hanno una morfologia irregolare post-infezione / selezione, consentire alle cellule di progredire attraverso più passaggi fino a quando la morfologia non ritorna alla normalità. Assicurarsi sempre che le linee di cellule utilizzate siano prive di contaminazione da micoplasma. Tra i molti effetti avversi dell’infezione da micoplasma, provoca anche danni al DNA delle cellule ospiti e potrebbe influenzare le loro vie DDR14,15. Il modo più sensibile per rilevare il micoplasma nella coltura cellulare è attraverso la PCR (versus. rilevamento con DAPI o Hoechst).
La sovraespressione ottimale della proteina di riparazione di interesse dovrebbe essere paragonabile ai livelli endogeni, tuttavia, abbastanza alta per il rilevamento. Il promotore utilizzato sui vettori virali, il titolo virale durante l’infezione e la durata del tempo di infezione possono essere regolati per i livelli di espressione ideali. Per risultati coerenti, isolare i singoli cloni cellulari per garantire livelli di espressione omogenei e una normale morfologia cellulare. Si raccomanda di utilizzare costrutti vettoriali che non sovraesprimano il PCNA marcato a livelli superiori a quelli endogeni per una corretta funzione di marcatore di riparazione del DNA e del ciclo cellulare. Anche bassi livelli di sovraespressione di PCNA sono sufficienti per discriminare le cellule in fase S. I vettori pBABE retrovirali sono stati utilizzati con successo per questo scopo (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PcNA può essere etichettato con qualsiasi proteina fluorescente monomerica rossa(ad esempio, mPlum, mCherry, mRuby, ecc.) o monomerica verde fluorescente (ad esempio, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, ecc.) che potrebbe quindi essere combinata con un POI alternativamente taggato. La sovraespressione di un POI con tag fluorescenti presenta alcune limitazioni e considerazioni. I tag fluorescenti possono interrompere la normale funzione e localizzazione delle proteine. Pertanto, la posizione del tag (N o C-terminale) deve essere considerata. Utilizzare sempre proteine fluorescenti monomeriche, poiché l’oligomerizzazione di varianti non monomeriche può influenzare la funzione del POI.
Le impostazioni laser devono essere determinate per ciascun sistema di imaging poiché molti componenti del percorso ottico influenzeranno la potenza effettiva erogata nelle celle. La microirraggiamento laser può causare diversi tipi di lesioni del DNA a seconda della lunghezza d’onda di eccitazione, della potenza erogata dal laser FRAP e se sono stati utilizzati agenti pre-sensibilizzanti (come Bromodeoxyuridine o Hoechst). I laser a 405 nm possono causare danni ossidativi al DNA, rotture a singolo e doppio filamento16,17. Utilizzando impostazioni di uscita laser più elevate, la quantità di DSB aumenta. In questo protocollo non sono stati utilizzati metodi di pre-sensibilizzazione, ma queste tecniche sono ampiamente trattate in letteratura e ricapitole nella discussione seguente. A nostro parere, il modo migliore per verificare se la lesione desiderata viene generata è testare il reclutamento di geni specifici del percorso di danno al DNA noti. Il reclutamento di NTHL1 o OGG1, componenti della via BER, suggerisce l’induzione delle basi di DNA ossidato10,11,17,18,19,mentre FBXL10 o XRCC5 indicano la presenza di DSB8,20,21. Il reclutamento di XRCC1 può indicare sia la presenza di basi di DNA ossidate che di rotture a singolo filamento (SSB)22,23. XPC (cioè RAD4) è un buon indicatore di NER che rimuove gli addotti di DNA voluminosi generati dalla luce ultravioletta (UV)17,24. Poiché il reclutamento di proteine esogene può introdurre alcune irregolarità, la colorazione immunofluorescente di proteine o marcatori di riparazione del DNA endogeno (come γH2A.X per le rotture a doppio filamento) può confermare la presenza di specifiche lesioni del DNA. In alternativa, potrebbero essere utilizzati anche anticorpi sollevati contro specifici tipi di lesioni del DNA. Per regolare la potenza del laser erogata, è possibile modificare sia il tempo di permanenza che la potenza del laser.
Con l’aiuto della modellazione matematica, è stato possibile eseguire un’analisi cinetica dettagliata in grado di fornire preziose informazioni sulle proprietà di reclutamento del POI (ad esempio, contributo di più domini di legame del DNA, sensibilità verso diversi eventi di segnalazione, ecc.). La valutazione automatizzata del reclutamento e il monitoraggio delle cellule potrebbero essere combinati per creare flussi di lavoro robusti 1,25.
Vantaggi e limiti della pre-sensibilizzazione del DNA
La pre-sensibilizzazione del DNA prima della micro-irradiazione è uno strumento comunemente usato per il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA16,17. La sensibilizzazione del DNA prima della micro-irradiazione lo rende più suscettibile ai DSB. I due metodi più comuni per la pre-sensibilizzazione del DNA sono il pre-trattamento delle cellule con bromodeossiuridina (BrdU) o colorante Hoechst. Per i sistemi non in grado di microirraggiare ad alte potenze laser, questi metodi possono essere necessari per indurre lesioni del DNA come i DSB. Inoltre, in assenza di un rivelatore di luce trasmessa o di un segnale fluorescente che evidenzi il nucleo cellulare (ad esempio, quando si studia il reclutamento di proteine di riparazione del DNA endogene senza tag), Hoechst agisce sia come strumento di presensibilizzante che come macchia nucleare fluorescente. Tuttavia, la pre-sensibilizzazione del DNA può introdurre complicazioni significative. BrdU (utilizzato ad una concentrazione finale di 10 μM) deve essere aggiunto alle cellule 24 ore (o tempo equivalente a un ciclo cellulare completo nella linea cellulare utilizzata) per incorporarsi correttamente nel DNA e può causare interferenze del ciclo cellulare26. Hoechst 33342 (utilizzato ad una concentrazione finale di 1 μg/mL) è citotossico dopo lunghi periodi di incubazione, ma richiede tempo sufficiente per saturare il nucleo con il colorante. Pertanto, dovrebbe essere applicato solo 15-20 minuti prima della microirraggiamento; in caso contrario, i dati di reclutamento non saranno coerenti. Le cellule macchiate in questo modo non possono essere tenute in coltura per più di qualche ora27,28. Assicurarsi di non utilizzare Hoechst 33358, che non è permeabile alle cellule come il colorante Hoechst 33342. La pre-sensibilizzazione può anche introdurre inutili variazioni tra gli esperimenti e rende l’esperimento ancora più sensibile alle differenze nella densità cellulare (poiché ciò influenzerà la quantità di colorante / cellula incorporato).
Vantaggi e limiti della microscopia confocale
La velocità di imaging della microscopia confocale può essere limitante rispetto alla microscopia a campo largo. Tuttavia, un microscopio confocale dotato di uno scanner risonante può migliorare enormemente la velocità di imaging (a scapito della risoluzione) avvicinandosi alle velocità della microscopia a disco rotante. Tre caratteristiche rendono il sistema confocale A1R HD25 una scelta eccellente per il protocollo qui presentato. In primo luogo, il FOV di 25 mm del sistema consente di eseguire l’immagine tra 15-20 celle in un singolo campo scansionato (rispetto alle 5-10 celle nelle configurazioni regolari), limitando il numero di acquisizioni necessarie per ottenere abbastanza celle per l’analisi statistica. In secondo luogo, il modulo FRAP e due teste di scansione consentono di image e micro-irradiare le cellule contemporaneamente, non solo in sequenza. Infine, la flessibilità di avere sia gli scanner risonanti che galvano offre la possibilità di passare facilmente tra l’imaging ad alta risoluzione temporale con una velocità eccezionale che riduce al minimo la tempra dei fluorofori e l’imaging ad alta risoluzione spaziale che utilizza velocità di scansione più lente per produrre immagini con un rapporto segnale/rumore più elevato. Mentre il sistema utilizzato consentiva la suddetta flessibilità, per assomigliare a configurazioni di microscopio confocale più ampiamente disponibili, solo lo scanner galvano è stato utilizzato negli esperimenti presentati (sia per la micro-irradiazione che per l’imaging successivo).
Vantaggi e limiti della microirraggiamento
Mentre la microirraggiamento fornisce una risoluzione spaziale e temporale senza rivali, non è senza limitazioni. Il danno al DNA da microirraggiamento laser è altamente raggruppato in parti specifiche del nucleo rispetto agli agenti dannosi presenti in natura. Pertanto, la risposta alla cromatina dovuta alla microirraggiamento può differire rispetto al danno distribuito in modo omogeneo. Inoltre, la microirraggiamento richiede molto tempo e può essere condotta solo su poche dozzine di cellule, mentre i metodi biochimici basati su grandi popolazioni (frazionamento della cromatina, immunoprecipitazione, ChIP) possono fornire una maggiore robustezza studiando migliaia di cellule alla volta. Verificare le osservazioni fatte dalla microirraggiamento con tecniche biochimiche tradizionali è una strategia efficace per conclusioni affidabili. Sebbene sia possibile la microirraggiamento simultaneo di molte cellule in un determinato FOV, il sistema di imaging avrà bisogno di più tempo per eseguire l’attività. Pertanto, misurare la dinamica delle proteine che reclutano molto rapidamente le lesioni del DNA limita il numero di possibili ROI per la microirraggiamento utilizzate contemporaneamente. Sul sistema di imaging utilizzato per questo protocollo, la microirraggiamento di un singolo ROI lungo 1024 pixel richiede 1032 ms utilizzando un tempo di permanenza di 1000 μs e 3088 ms utilizzando un tempo di permanenza di 3000 μs per essere completato. L’utilizzo di più linee di ROI aumenterà significativamente il tempo necessario per completare la microirraggiamento (ad esempio, il ROI lungo 7 x 1024 pixel richiede 14402 ms utilizzando il tempo di permanenza di 1000 μs e 21598 ms utilizzando il tempo di permanenza di 3000 μs). Questo tempo è perso dall’acquisizione di immagini e deve essere preso in considerazione. Quando si visualizzano eventi di reclutamento rapido, utilizzare il ROI più breve possibile e micro-irradiare solo una cella alla volta.
Vantaggi e limitazioni rispetto ai metodi di sincronizzazione
Per gli studi specifici del ciclo cellulare, i metodi esistenti prevedono la sincronizzazione delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare o l’utilizzo di reporter fluorescenti per identificare la specifica fase del ciclo cellulare della cellula. Tuttavia, ognuno di questi metodi fornisce le proprie sfide e limitazioni.
Il sistema FUCCI3 (che si basa su proteine fluorescenti marcate forme troncate di CDT1 e Geminina) è uno strumento particolarmente utile per gli studi sul ciclo cellulare, ma ha dei limiti quando si tratta di differenziare tra le fasi S e G2 del ciclo cellulare. I livelli di Geminina sono già alti dalla fase S media e rimangono alti fino alla fase M, rendendo queste fasi difficili da separare. L’utilizzo del sistema FUCCI significa anche che due canali ottici del microscopio non possono essere utilizzati per l’imaging del POI.
Le linee cellulari non tumorali potrebbero essere sincronizzate in G0 mediante la rimozione dei fattori di crescita trovati nel siero (fame sierica) causando poco o nessun danno al DNA alle cellule. Tuttavia, la maggior parte delle linee cellulari tumorali continuerà parzialmente a progredire attraverso il ciclo cellulare anche senza adeguate quantità di siero nei loro mezzi. Inoltre, le cellule iniziano parzialmente a perdere la sincronizzazione entro la fine di G1, la fase S iniziale. Oltre alla fame di siero, ci sono numerosi metodi chimici per ottenere la sincronizzazione del ciclo cellulare. I blocchi di idrossiurea, afildicolina e timidina sono metodi per fermare la replicazione del DNA per sincronizzare le cellule nella fase S iniziale. Mentre questi metodi sono economici e semplici, introducono lo stress di replicazione che provoca danni al DNA. Questi inibitori della replicazione del DNA hanno dimostrato di indurre la fosforilazione di H2A. X, un noto marcatore di DSB2,29. Il metodo di utilizzo del PCNA marcato come marcatore per le cellule in fase S riduce il potenziale di artefatti causati dalla sincronizzazione chimica e può essere applicato a una vasta gamma di linee cellulari rispetto alla fame sierica.
Conclusione
Il danno al DNA è una forza trainante per le malattie genetiche in cui le lesioni mutagene possono portare alla trasformazione maligna delle cellule. Il targeting del meccanismo di sintesi del DNA è una strategia terapeutica fondamentale nel trattamento di malattie iperproliferative come il cancro. Per trattare queste malattie in modo più mirato, abbiamo bisogno di una migliore comprensione delle proteine che riparano le lesioni del DNA. Il protocollo qui descritto aiuta gli studi basati sulla microirraggiamento in fase S riducendo al minimo le sfide presentate dai metodi di sincronizzazione tradizionali per ridurre i possibili artefatti e aumentare la riproducibilità degli esperimenti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano M. Pagano per il suo continuo supporto così come D. Simoneschi, A. Marzio e G. Tang per la loro revisione critica del manoscritto. B. Miwatani-Minter ringrazia R. Miwatani e B. Minter per il loro continuo supporto. G. Rona ringrazia K. Ronane Jurasz e G. Rona per il loro continuo supporto.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
| Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
| Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
| DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
| EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
| EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
| HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
| McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
| mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
| Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
| Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
| Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
| Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
| Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
| Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
| NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
| Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
| Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
| pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
| polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
| pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
| pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
| Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
| U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
| VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |
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