S期におけるDNA採用を研究するレーザーマイクロ照射
Summary
このプロトコルは、レーザーマイクロ照射によるDNA修復タンパク質の採用測定など、下流顕微鏡研究のためのS相細胞を効率的に同定するための非侵襲的な方法を記述する。
Abstract
DNA損傷修復は、反応性の高い環境で細胞の遺伝的完全性を維持します。細胞は、代謝活動や紫外線などの内因性および外因性の両方の原因による様々なタイプのDNA損傷を蓄積し得る。DNA修復がなければ、細胞の遺伝コードが損なわれ、タンパク質の構造や機能が損なわれ、病気を引き起こす可能性があります。
様々な細胞周期過程における異なるDNA修復経路の時空間的ダイナミクスを理解することは、DNA損傷修復の分野で重要である。現在の蛍光顕微鏡技術は、DNA損傷誘導後の異なる修復タンパク質の採用運動を測定するための優れたツールを提供します。細胞周期のS相中のDNA合成は、DNA修復に関する細胞運命の特異な点である。これは、間違いのためにゲノム全体をスクリーニングするためのユニークなウィンドウを提供します。同時に、DNA合成エラーは、非分裂細胞では検出されないDNA完全性に対する脅威にもなります。したがって、DNA修復プロセスは、細胞周期の他の段階と比較してS相において有意に異なり、それらの違いは十分に理解されていない。
以下のプロトコルは、405nmレーザーラインを搭載したレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて、細胞株の調製およびS相におけるDNA修復タンパク質のダイナミクスの測定を記述する。タグ付きPCNA(mPlum付き)は、関心のあるAcGFP標識修復タンパク質(すなわちEXO1b)と組み合わせた細胞周期マーカーとして使用され、S相におけるDNA損傷の採用を測定する。
Introduction
いくつかのDNA修復経路は、細胞内で発生する可能性のあるさまざまなタイプのDNA病変に対処するために進化しており、そのすべてが空間と時間の両方で高度に調節されています。細胞周期の最も脆弱な期間の1つは、DNA合成が起こるS相である。増殖は生命の基本である一方で、大きな課題でもあります。細胞は、突然変異が将来の世代に受け継がれないように、ゲノムの忠実な複製を確実にする必要があります。その結果、増殖は、腫瘍学の分野における治療アプローチの開発に用いられてきた治療的介入点を提供する。
DNA病変におけるタンパク質のリクルートを研究するために使用される主要な技術には、その強みと限界があります。マイクロ照射は、イオン化放射線誘導病巣(IRIF)、クロマチン免疫沈降(ChIP)、または生化学的分別の免疫蛍光イメージングのような代替方法のほとんどよりも、空間的および時間的分解能1 を有する。しかし、マイクロ照射ラックは、同時に多数の細胞をサンプリングすることができる前述の技術の堅牢性をlac.
S相でDNA修復を調べるには、非同期細胞培養集団中のS相細胞を区別できなければならない。これに対処する多くのよく知られた方法は、細胞の同期、または異なる細胞周期の段階の視覚化を含む。しかし、どちらのアプローチも、重大な課題と可能なアーティファクトを導入します。S初期の段階で細胞を濃縮するために広く使用される化学同期方法(例えば、二重チミジンブロック、アブフィジコリン、ヒドロキシ尿素処理)は、複製応力の誘導および最終的にはDNA損傷自体を通じて同期を達成する。これにより、Sフェーズ2でDNA修復プロセスを研究するためのこれらの方法の使用が制限されます。血清飢餓および放出による同期は、非形質細胞株と比較して細胞周期進行の成長因子に依存しない癌細胞株を主に除く、限られた数の細胞株にのみ適用可能である。蛍光ユビキチン細胞周期指標(FUCCI)システムは、細胞周期を研究するのに特に有用なツールであるが、SとG2細胞周期相を分化する場合には基本的な制限がある。
ここでは、蛍光タグ付きPCNAを非侵襲的なS相マーカーとして使用すると、化学細胞サイクル同期方法の欠点を制限し、FUCCIシステムよりも特異性と柔軟性を可能にすることが示されています。単一マーカーとして、PCNAは非同期集団におけるS相細胞を強調できるだけでなく、S相内の細胞の正確な進行(すなわち、早期、中期、後期S相)4を示すことができる。外因性の低い発現レベル、タグ付きPCNAは、細胞周期進行およびDNA修復プロセスの両方に対する最小限の干渉を保証します。重要なことに、PCNAは、複数のDNA病変の修復に関与し、局所的に誘発されたDNA損傷部位1、4に採用される、適切なDNA損傷誘導のための内部制御としても機能する。
ここで示した実験は、S相でEXO1bの採用ダイナミクスを測定する方法と、これが確立されたPARP阻害剤であるオラパリブによってどのように影響を受けるかを示しています。EXO1bヌクレアーゼ活性は、ミスマッチ修復(MMR)、ヌクレオチド切除修復(NER)、および二本鎖破断(DSB)修復を含む幅広いDNA修復経路に関連しています。S相では、EXO1bはDNA切除5中に3’ssDNAオーバーハングの形成を通じて相同組換え(HR)に大きな役割を果たす。EXO1bは、停止したDNAフォークを再開するチェックポイント活性化における役割を持つDNA複製にさらに関与しており、また、複製5におけるストランド変位時の遅れ鎖でのプライマー除去および岡崎フラグメント成熟を再開する。損傷したDNAサイトへのEXO1bのリクルートメントは、ポリ(ADP-リボース)(PAR)6,7との直接相互作用によって調節される。EXO1bの細胞周期特異的な意味が数多くあるため、PCNAを用いたS相特異的採用研究に最適です。
Protocol
Representative Results
Discussion
重要なステップと、プロトコルのトラブルシューティング/変更の可能性
マイクロ照射のための適切な組織培養容器は、成功のために重要です。ほとんどの高解像度イメージングシステムは、0.17 mm のカバーガラスの厚さに最適化されています。より高いまたはより低い厚さのイメージ投射室またはプラスチックポリマーから作られたもの(405 nmのイメージ投射のために最大限に活用されない)を使用して、著しくイメージの質を減らすことができる。ガラス表面を使用する場合は、細胞接着を強化するために処理された組織培養であることを確認してください。それらが組織培養処理されていない場合、これらのチャンバーは、例えば、細胞を播種する前にポリD-リジンでコーティングする必要があります。チャンバーカバーグラスに細胞をめっきする場合、細胞周期の不規則性や細胞への追加応力を避けるために理想的な細胞密度が最優先されます。安定した温度を維持するために実験する前に顕微鏡部品の適切な熱平衡は、時間経過イメージングを通じて焦点を維持するために重要であり、また、時間とサンプルにわたって均質なDDRを確保するために必要です。
細胞は、アーテフの実測データを減らすために、マイクロ照射の前に健康な状態にあることが重要です。細胞が感染後/選択した不規則な形態を有する場合、形態が正常に戻るまで細胞が複数の通路を進むことを可能にする。使用する細胞ラインにマイコプラズマ汚染が含まれるのを常に確認してください。マイコプラズマ感染の多くの有害作用の中で、それはまた、宿主細胞にDNA損傷を引き起こし、それらのDDR経路14、15に影響を与える可能性がある。細胞培養でマイコプラズマを検出する最も敏感な方法は、PCR(DAPIまたはHoechstによる検出に対する)を介して行います。
目的の修復タンパク質の最適な過剰発現は、しかし、検出するのに十分な高い内因性レベルに匹敵する必要があります。ウイルスベクターに使用されるプロモーター、感染時のウイルスの引き量体、および感染時間の長さはすべて、理想的な発現レベルに合わせて調整することができる。一貫した結果を得るために、個々の細胞クローンを分離して、均質な発現レベルと正常な細胞形態を確保する。適切な細胞周期およびDNA修復マーカー機能のために、内因性レベルよりも高いタグ付きPCNAを過剰発現しないベクター構築物を使用することが推奨される。PCNA過剰発現の低レベルであっても、S相細胞を判別するのに十分である。レトロウイルス pBABE ベクターは、この目的のために正常に使用されています (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767).PCNAは、任意の単量体赤色(例えば、mPlum、mCherry、mRuby など)または単量体緑色蛍光タンパク質(例えば、mEGFP、AcGFP、mWasabi、mNeonGreen、mEmeraldなど)でタグ付けすることができ、交互にタグ付けされたPOIと組み合わせることができます。蛍光タグ付き POI を過剰表現する場合、いくつかの制限と考慮事項があります。蛍光タグは、正常なタンパク質機能および局在化を妨げる可能性があります。したがって、タグの位置(NまたはC末端)を考慮する必要があります。非単量体変異体のオリゴマー化がPOIの機能に影響を与える可能性があるとして、常に単量体蛍光タンパク質を使用する。
光路の多くのコンポーネントが細胞に送達される実際の電力に影響を与えるため、レーザー設定は各イメージングシステムごとに決定する必要があります。レーザー微小照射は、励起波長、FRAPレーザーの出力、および任意のプレ感作剤(ブロモデキシウリジンまたはホーチストのような)が使用された場合に、いくつかのタイプのDNA病変を引き起こす可能性があります。405 nmレーザーは、酸化的DNA損傷、単鎖および二本鎖破断16、17を引き起こす可能性があります。レーザー出力設定値を高くすることで、DSBの量が増加します。このプロトコルでは、予感作法は利用されなかったが、これらの技術は文献で大きくカバーされ、以下の議論で再びキャップされている。我々の意見では、所望の病変が生成されるかどうかをテストする最良の方法は、既知のDNA損傷経路特異的遺伝子の同定を試験することによってである。NTHL1またはOGG1の募集は、BER経路の成分、酸化DNA塩基10、11、17、18、19の誘導を示唆し、FBXL10またはXRCC5はDSBs8、20、21の存在を示す。XRCC1の採用は、酸化DNA塩基と単一鎖破断(SSB)22,23の両方の存在を示すことができる。XPC(すなわち、RAD4)は、紫外線(UV)17、24によって生成されるかさばるDNA付加物を除去するNERの良い指標である。外因性タンパク質をリクルートすると、ある種の不規則性を導入する可能性があるため、内因性DNA修復タンパク質またはマーカー(二本鎖破断のγH2A.Xなど)の免疫蛍光染色は、特定のDNA病変の存在を確認することができる。あるいは、特定のタイプのDNA病変に対して提起された抗体も使用できる。送達されたレーザーパワーを調整するために、ドウェル時間とレーザーパワーの両方を変更することができます。
数学的モデリングの助けを借りて、POIの採用特性(例えば、複数のDNA結合ドメインの寄与、異なるシグナル伝達事象に対する感受性)に関する貴重な洞察を提供できる詳細な運動分析を行うことができる。自動採用評価と細胞追跡を組み合わせて、堅牢なワークフロー 1,25を作成できます。
DNAプリリシタイズの利点と限界
マイクロ照射前のDNAの予感作は、DNA修復タンパク質募集16,17に一般的に用いられるツールである。微量照射前の感作DNAは、DSBの影響を受けやすくなります。DNAの予感作のための2つの最も一般的な方法は、ブロモデキシウリジン(BrdU)またはHoechst色素のいずれかによる細胞の前処理です。高いレーザーパワーでマイクロ照射ができないシステムでは、これらの方法はDSBのようなDNA病変を誘発するために必要である可能性があります。しかし、DNAの予感作は重大な合併症を導入する可能性がある。BrdU(10 μMの最終濃度で使用される)は、DNAに適切に組み込むために細胞に24時間(または使用される細胞株の全細胞周期に相当する時間)に添加する必要があり、細胞周期干渉を引き起こす可能性がある26。Hoechst 33342(1 μg/mLの最終濃度で使用される)は、長いインキュベーション期間の後に細胞毒性を有するが、色素で核を飽和するのに十分な時間を必要とする。したがって、マイクロ照射の15〜20分前にのみ適用する必要があります。それ以外の場合、採用データは一貫していません。このように染色された細胞は、27,28時間以上培養中に保てることができない。Hoechst 33342染料ほど透過性の細胞ではないHoechst 33358を使用しないでください。事前感作は実験間で不要な分散を導入し、細胞密度の違いにより敏感な実験を行う(これは組み込まれた色素/細胞の量に影響を与えるため)。
共焦点顕微鏡の利点と限界
共焦点顕微鏡のイメージング速度は、広視野顕微鏡と比較して制限される可能性があります。しかし、共振スキャナを搭載した共焦点顕微鏡は、回転ディスク顕微鏡の速度に近づく(分解能を犠牲にして)イメージング速度を大幅に向上させることができます。3つの特徴はA1R HD25の共焦点システムをここに提示される議定書のための優秀な選択にする。まず、システムの25mm FOVは、単一のスキャンフィールド(通常の設定では5〜10セル対5〜10セル)の15〜20個の細胞間で画像を作成し、統計分析に十分な細胞を得るために必要な取得数を制限することを可能にします。第二に、FRAPモジュールと2つのスキャンヘッドは、連続的にだけでなく、同時に細胞を画像化し、マイクロ照射することを可能にする。最後に、共振とガルバノスキャナの両方を持つ柔軟性は、蛍光葉の消光を最小限に抑える例外的な速度で高テンポラル解像度イメージングを簡単に切り替える機能と、より低速なスキャン速度を利用して高い信号対ノイズ比で画像を生成する高空間分解能イメージングを容易に行うことができます。上記の柔軟性を可能にする使用システムでは、より広く利用可能な共焦点顕微鏡構成に似たが、ガルバノスキャナのみが提示された実験(マイクロ照射および後続のイメージングの両方に対して)に使用された。
マイクロ照射の利点と限界
マイクロ照射は比類のない空間的および時間的分解能を提供するが、それは制限がないわけではない。レーザーマイクロ照射によるDNA損傷は、天然の損傷剤と比較して、核の特定の部分に非常にクラスター化されています。したがって、マイクロ照射によるクロマチン応答は、均質に分散した損傷と比較して異なる場合がある。さらに、微量照射は時間がかかり、数十個の細胞にしか行われないかもしれないが、大規模な集団ベースの生化学的方法(クロマチン分別、免疫沈降、ChIP)は、一度に何千もの細胞を研究することによって、より高い堅牢性を提供することができる。従来の生化学的手法によるマイクロ照射による観測の検証は、信頼できる結論を得るための効果的な戦略です。あるFOV内の多くの細胞に対して同時にマイクロ照射が可能であるが、撮像システムは、この作業を行うためにより多くの時間を必要とするだろう。したがって、DNA病変に非常に迅速にリクルートするタンパク質のダイナミクスを測定すると、同時に使用されるマイクロ照射に対する可能なROIの数が制限されます。このプロトコルに使用されるイメージングシステムでは、1024ピクセルの長いROIのマイクロ照射は、1000 μsのドウェル時間を使用して1032 ms、3000 μsのドウェル時間を使用して3088 msを使用して完了します。複数のROIラインを使用すると、マイクロ照射を完了するのに必要な時間が大幅に増加します(例えば、7 x 1024ピクセルの長さのROIは1000 μsのドウェル時間を使用して14402 ms、3000 μsのドウェル時間を使用して21598 msかかります)。この時間は画像取得から失われ、考慮する必要があります。迅速な採用イベントを撮影する場合は、可能な限り最短のROIを使用し、一度に1つのセルのみをマイクロ照射します。
同期方式に対する利点と制限
細胞周期特異的研究では、既存の方法は、細胞を特定の細胞周期相に同期させるか、蛍光レポーターを使用して細胞の特定の細胞周期段階を同定することを含む。ただし、これらの各方法には、独自の課題と制限があります。
FUCCIシステム3(CDT1およびジェミニンの切り捨てられた形の蛍光タンパク質に依存する)は細胞周期の研究のために特に有用な用具であるが、細胞周期のSおよびG2相の間の分化に関しては限界がある。ジェミニンレベルは、すでに中期S相から高く、M相まで高く保たれ、これらの相を分離することは困難です。FUCCIシステムを使用すると、2つの光学チャネルを使用して、POIをイメージングすることはできません。
非癌細胞株は、血清中に見られる成長因子(血清飢餓)を除去することによってG0に同期させることができ、細胞に対するDNA損傷はほとんどまたは全く起こさなかった。しかし、ほとんどの癌細胞株は、培地に十分な量の血清がなくても、細胞周期を経て部分的に進行し続けるだろう。さらに、セルは部分的に G1 後期、初期 S フェーズまでに同期を失い始めます。血清飢餓に加えて、細胞周期の同期を達成するために多数の化学的方法がある。ヒドロキシ尿素、アブフィジコリン、チミジンブロックは、DNA複製を停止して細胞を初期S相に同期させる方法です。これらの方法は安価でシンプルですが、複製ストレスを引き起こし、DNA損傷をもたらします。これらのDNA複製阻害剤は、H2Aのリン酸化を誘導することが示されている。X は、DSBs2,29のよく知られたマーカーです。S相細胞のマーカーとしてタグ付きPCNAを用いる方法は、化学的な同期によって引き起こされるアーティファクトの可能性を低減し、血清飢餓と比較して広範囲の細胞株に適用することができる。
結論
DNA損傷は、変異原性病変が細胞の悪性形質転換につながる可能性のある遺伝性疾患の原動力です。DNA合成機を標的とすることは、がんのような超増殖性疾患の治療における基本的な治療戦略である。これらの疾患をより標的にした方法で治療するためには、DNA病変を修復するタンパク質をよりよく理解する必要があります。ここで説明するプロトコルは、従来の同期手法によって提示される課題を最小限に抑え、可能なアーティファクトを低減し、実験の再現性を高めることによって、S段階でのマイクロ照射ベースの研究に役立ちます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、M.パガーノの継続的な支援に感謝し、D.シモネスキ、A.マルツィオ、G.タンが原稿の批判的なレビューを行ってくれたことに感謝しています。B.三和谷ミンターは、R.三和谷とB.ミンターの継続的なサポートに感謝します。G・ロナは、K・ロナネ・ジュラシュとG・ロナの継続的な支援に感謝します。
Materials
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
| Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
| Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
| DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
| EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
| EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
| HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
| McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
| mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
| Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
| Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
| Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
| Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
| Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
| Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
| NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
| Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
| Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
| pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
| polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
| pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
| pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
| Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
| U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
| VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |
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