Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S
Summary
Este protocolo descreve um método não invasivo para identificar eficientemente células da fase S para estudos de microscopia a jusante, como medir o recrutamento de proteínas de reparação de DNA por micro-irradiação a laser.
Abstract
O reparo de danos no DNA mantém a integridade genética das células em um ambiente altamente reativo. As células podem acumular vários tipos de dano de DNA devido a fontes endógenas e exógenas, como atividades metabólicas ou radiação UV. Sem reparação de DNA, o código genético da célula fica comprometido, minando as estruturas e funções das proteínas e potencialmente causando doenças.
Compreender a dinâmica espostetemporal das diferentes vias de reparação de DNA em várias fases do ciclo celular é crucial no campo da reparação de danos no DNA. As técnicas atuais de microscopia fluorescente fornecem ótimas ferramentas para medir a cinética de recrutamento de diferentes proteínas de reparo após a indução de danos no DNA. A síntese de DNA durante a fase S do ciclo celular é um ponto peculiar no destino celular em relação à reparação do DNA. Ele fornece uma janela única para tela de todo o genoma em busca de erros. Ao mesmo tempo, os erros de síntese de DNA também representam uma ameaça à integridade do DNA que não é encontrada em células não-divisórias. Portanto, os processos de reparação de DNA diferem significativamente na fase S em comparação com outras fases do ciclo celular, e essas diferenças são mal compreendidas.
O protocolo a seguir descreve a preparação de linhas celulares e a medição da dinâmica das proteínas de reparação de DNA na fase S em locais de dano de DNA induzidos localmente, usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com uma linha laser de 405 nm. PcNA marcada (com mPlum) é usado como um marcador de ciclo celular combinado com uma proteína de reparação rotulada acgFP (ou seja, EXO1b) para medir o recrutamento de danos de DNA na fase S.
Introduction
Várias vias de reparação de DNA evoluíram para abordar os diferentes tipos de lesões de DNA que podem surgir nas células, todas altamente reguladas no espaço e no tempo. Um dos períodos mais vulneráveis do ciclo celular é a fase S, quando ocorre a síntese de DNA. Embora a proliferação seja fundamental para a vida, ela também oferece um grande desafio. As células precisam garantir a replicação fiel de seu genoma para evitar que mutações sejam transmitidas para as gerações futuras. Consequentemente, a proliferação proporciona um ponto terapêutico de intervenção que tem sido empregado para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas no campo da oncologia.
Todas as principais técnicas utilizadas para o estudo do recrutamento de proteínas em lesões de DNA têm seus pontos fortes e limitações. A micro-irradiação tem melhor resolução espacial e temporal1 do que a maioria dos métodos alternativos como imagens imunofluorescentes de focos induzidos por radiação ionizante (IRIF), cromatina-imunoprecipitação (ChIP) ou fracionamento bioquímico. No entanto, a micro-irradiação mistura a robustez das técnicas acima mencionadas que podem amostrar um grande número de células ao mesmo tempo.
Para investigar o reparo de DNA na fase S, é preciso ser capaz de distinguir células da fase S em uma população de cultura celular assíncrona. Existem muitos métodos bem conhecidos para lidar com isso, envolvendo a sincronização das células ou a visualização das diferentes fases do ciclo celular. No entanto, ambas as abordagens introduzem desafios significativos e possíveis artefatos. Métodos de sincronização química amplamente utilizados para enriquecer células na fase S inicial (por exemplo, bloco de timmidina dupla, aphidicolina e tratamento de hidroxyurea) alcançam a sincronização através da indução do estresse de replicação e eventualmente danos do DNA em si. Isso limita o uso desses métodos para estudar processos de reparação de DNA na faseS 2. A sincronização através da fome e liberação de soro só é aplicável a um número limitado de linhas celulares, excluindo em grande parte linhas de células cancerígenas que dependem menos de fatores de crescimento para a progressão do ciclo celular em comparação com linhas celulares não transformadas. O sistema FUCCI (Fluorescence Ubiquitin Cell Cycle Indicator, indicador de ciclo celular de fluorescência) é uma ferramenta particularmente útil para estudar o ciclo celular, mas tem uma limitação fundamental ao diferenciar entre as fases do ciclo celular S e G23.
Aqui é demonstrado que o uso de PCNA fluorescentemente marcado como um marcador não invasivo para a fase S limita as desvantagens dos métodos de sincronização do ciclo celular químico, ao mesmo tempo em que permite mais especificidade e flexibilidade do que o sistema FUCCI. Como um único marcador, o PCNA não só pode destacar células de fase S em uma população assíncrona, mas também pode mostrar a progressão exata das células dentro da fase S (ou seja, precoce, média ou tardia fase S)4. Baixos níveis de expressão de PCNA exógeno e marcado garante interferência mínima tanto com a progressão do ciclo celular quanto com os processos de reparação de DNA. É importante ressaltar que o PCNA também serve como um controle interno para a indução adequada de danos ao DNA, pois está envolvido na reparação de várias lesões de DNA e é recrutado para locais de dano de DNA induzido localmente1,4.
Os experimentos aqui apresentados demonstram como medir a dinâmica de recrutamento do EXO1b na fase S e como isso é afetado pelo bem estabelecido inibidor parp, olaparibe. A atividade de nuclease EXO1b é relevante para uma ampla gama de vias de reparo de DNA, incluindo reparo incompatível (MMR), reparo de excisão de nucleotídeos (NER) e reparo de quebra de dois fios (DSB). Na fase S, o EXO1b desempenha um papel importante na recombinação homologous (RH) através da formação de ssDNA de 3′ durante a ressecção de DNA5. EXO1b foi ainda mais implicado na replicação de DNA com papéis na ativação de checkpoint para reiniciar garfos de DNA parados parados, bem como remoção de primer e maturação de fragmentos okazaki no fio defasado durante o deslocamento do fio na replicação5. O recrutamento EXO1b para locais de DNA danificados é regulado pela interação direta com poli (ADP-ribose) (PAR)6,7. Devido às inúmeras implicações específicas do ciclo celular do EXO1b, é uma excelente escolha para estudos de recrutamento específicos da fase S usando PCNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas e possíveis problemas de solução de problemas/modificações do protocolo
O vaso de cultura tecidual adequado para micro-irradiação é fundamental para o sucesso. A maioria dos sistemas de imagem de alta resolução são otimizados para espessura de vidro de cobertura de 0,17 mm. O uso de câmaras de imagem de espessura maior ou inferior ou feitas de polímeros plásticos (não otimizados para imagens de 405 nm), pode reduzir significativamente a qualidade da imagem. Ao usar superfícies de vidro, certifique-se de que elas são de cultura tecidual tratada para aumentar a adesão celular. Se não forem tratadas com cultura tecidual, essas câmaras precisarão ser revestidas, por exemplo, com poli-d-lysina antes de semear as células. Ao emplacar células no vidro de cobertura câmara, a densidade celular ideal é primordial para evitar irregularidades no ciclo celular e estresse adicional para as células. O equilíbrio térmico adequado dos componentes do microscópio antes da experimentação para manter uma temperatura estável é crucial tanto para manter o foco durante todo o lapso de tempo quanto também é necessário para garantir um DDR homogêneo através do tempo e amostras.
É fundamental que as células estejam em uma condição saudável antes da micro-irradiação para reduzir os dados artefatos. Se as células tiverem morfologia irregular pós-infecção/seleção, permitam que as células progridam através de múltiplas passagens até que a morfologia volte ao normal. Certifique-se sempre de que as linhas de células utilizadas estão livres de contaminação por mycoplasma. Entre os muitos efeitos adversos da infecção por micoplasma, também causa danos ao DNA das células hospedeiras e pode afetar suas vias DDR14,15. A maneira mais sensível de detectar mycoplasma na cultura celular é através do PCR (versus. detecção com DAPI ou Hoechst).
A superexpressão ideal da proteína de reparação de interesse deve ser comparável aos níveis endógenos, no entanto, alto o suficiente para detecção. O promotor usado nos vetores virais, no título viral durante a infecção e no tempo de infecção podem ser ajustados para níveis ideais de expressão. Para resultados consistentes, isole clones de células individuais para garantir níveis de expressão homogêneos e morfologia celular normal. Recomenda-se o uso de construções vetoriais que não expressam pcna etiquetada em níveis superiores aos níveis endógenos para a função adequada do ciclo celular e do marcador de reparo de DNA. Mesmo os baixos níveis de superexpressão do PCNA são suficientes para discriminar células da fase S. Os vetores retrovirais pBABE foram usados com sucesso para este fim (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA pode ser marcado com qualquer vermelho monomérico(por exemplo, mPlum, mCherry, mRuby, etc.) ou proteínas fluorescentes verdes monoméricas (por exemplo, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, etc.) que poderiam então ser combinadas com um POI marcado alternadamente. Superexpressar um POI marcado fluorescentemente tem algumas limitações e considerações. As etiquetas fluorescentes podem interromper a função normal da proteína e a localização. Assim, deve-se considerar a localização da tag (N ou terminal C). Use sempre proteínas fluorescentes monoméricas, pois a oligomerização de variantes não monoméricas pode afetar a função do POI.
As configurações de laser devem ser determinadas para cada sistema de imagem, pois muitos componentes do caminho óptico afetarão a potência real entregue nas células. A micro-irradiação a laser pode causar vários tipos de lesões de DNA dependendo do comprimento de onda de excitação, da saída de energia do laser FRAP e se algum agente pré-sensibilizador (como Bromodeoxyuridine ou Hoechst) foi usado. Lasers de 405 nm podem causar danos oxidativos ao DNA, quebras de um único e duplo encalhados16,17. Usando configurações de saída de laser mais altas, a quantidade de DSBs aumenta. Neste protocolo, não foram utilizados métodos de pré-sensibilização, mas essas técnicas são muito abordadas na literatura e recapitudas na discussão abaixo. Em nossa opinião, a melhor maneira de testar se a lesão desejada é gerada é através de testes para o recrutamento de genes específicos da via de dano de DNA conhecidos. O recrutamento de NTHL1 ou OGG1, componentes da via BER, sugere a indução de bases de DNA oxidadas10,11,17,18,19, enquanto FBXL10 ou XRCC5 indicam a presença de DSBs8,20,21. O recrutamento do XRCC1 pode indicar tanto a presença de bases de DNA oxidadas quanto quebras únicas encalhadas (SSB)22,23. XPC (i.e., RAD4) é um bom indicador de NER que remove os adutos de DNA volumosos gerados pela luz ultravioleta (UV)17,24. Como o recrutamento de proteínas exógenas pode introduzir certas irregularidades, a coloração imunofluorescente de proteínas ou marcadores de reparação de DNA endógeno (como γH2A.X para quebras duplas) pode confirmar a presença de lesões específicas de DNA. Alternativamente, anticorpos levantados contra tipos específicos de lesões de DNA também poderiam ser usados. Para ajustar a potência do laser entregue, tanto o tempo de moradia quanto a potência do laser podem ser alterados.
Com a ajuda da modelagem matemática, poderia ser realizada uma análise cinética detalhada que pode fornecer insights valiosos sobre as propriedades de recrutamento do POI (por exemplo, contribuição de múltiplos domínios de ligação de DNA, sensibilidade para diferentes eventos de sinalização, etc.). A avaliação automatizada de recrutamento e o rastreamento de células podem ser combinados para criar fluxos de trabalho robustos 1,25.
Vantagens e limitações da pré-sensibilização do DNA
A pré-sensibilização do DNA antes da micro-irradiação é uma ferramenta comumente usada para recrutamento de proteínas de reparação de DNA16,17. Sensibilizar o DNA antes da micro-irradiação o deixa mais suscetível aos DSBs. Os dois métodos mais comuns para pré-sensibilização do DNA são o pré-tratamento de células com bromodeoxyuridina (BrdU) ou corante hoechst. Para sistemas não capazes de micro-irradiação em altas potências laser, esses métodos podem ser necessários para induzir lesões de DNA como DSBs. Além disso, na ausência de um detector de luz transmitido ou de um sinal fluorescente destacando o núcleo celular (por exemplo, ao estudar o recrutamento de proteínas de reparação de DNA endógenas não sinalizadas), Hoechst atua como uma ferramenta pré-sensibilizadora e uma mancha fluorescente nuclear. No entanto, a pré-sensibilização do DNA pode introduzir complicações significativas. A BRDU (usada em uma concentração final de 10 μM) deve ser adicionada às células 24 horas (ou tempo equivalente a um ciclo celular completo na linha celular utilizada) para incorporar adequadamente no DNA e pode causar interferência no ciclo celular26. Hoechst 33342 (usado em uma concentração final de 1 μg/mL) é citotóxico após longos períodos de incubação, mas requer tempo suficiente para saturar o núcleo com o corante. Portanto, só deve ser aplicado 15-20 minutos antes da microdiarração; caso contrário, os dados de recrutamento não serão consistentes. As células manchadas dessa forma não podem ser mantidas na cultura por mais de algumas horas27,28. Certifique-se de não usar hoechst 33358, que não é tão permeável celular quanto o corante Hoechst 33342. A pré-sensibilização também pode introduzir variância desnecessária entre os experimentos e torna o experimento ainda mais sensível às diferenças na densidade celular (pois isso afetará a quantidade de corante/célula incorporada).
Vantagens e limitações da microscopia confocal
A velocidade de imagem da microscopia confocal pode ser limitante quando comparada à microcopia de campo largo. No entanto, um microscópio confocal equipado com um scanner ressonante pode melhorar tremendamente a velocidade de imagem (ao custo da resolução) chegando perto das velocidades de microscopia de disco giratório. Três recursos fazem do sistema confocal A1R HD25 uma excelente escolha para o protocolo apresentado aqui. Primeiro, o FOV de 25 mm do sistema permite a imagem entre 15-20 células em um único campo digitalizado (vs. 5-10 células em configurações regulares), limitando o número de aquisições necessárias para obter células suficientes para análise estatística. Em segundo lugar, o módulo FRAP e dois scanheads tornam possível a imagem e micro-irradiação das células simultaneamente, não apenas sequencialmente. Por fim, a flexibilidade de ter tanto os scanners ressonantes quanto os galvanos fornece a capacidade de alternar facilmente entre imagens de alta resolução temporal com velocidade excepcional, o que minimiza a sacieçação de fluoroforos, e imagens de alta resolução espacial que utilizam velocidades de varredura mais lentas para produzir imagens com uma maior relação de sinal para ruído. Embora o sistema utilizado permitisse que a flexibilidade acima mencionada, se assemelhasse a configurações de microscópio confocal mais amplamente disponíveis, apenas o scanner galvano foi usado nos experimentos apresentados (tanto para micro-irradiação quanto para imagens subsequentes).
Vantagens e limitações da micro-irradiação
Embora a micro-irradiação forneça resolução espacial e temporal incomparável, não é sem limitações. O dano de DNA por micro-irradiação a laser é altamente agrupado a partes específicas do núcleo em comparação com agentes prejudiciais que ocorrem naturalmente. Assim, a resposta da cromatina devido à microdiaração pode diferir em comparação com danos distribuídos homogêneamente. Além disso, a micro-irradiação é demorada e só pode ser conduzida em algumas dezenas de células, enquanto grandes métodos bioquímicos de base populacional (fracionamento de cromatina, imunoprecipitação, ChIP) podem fornecer maior robustez estudando milhares de células ao mesmo tempo. Verificar observações feitas por micro-irradiação com técnicas bioquímicas tradicionais é uma estratégia eficaz para conclusões confiáveis. Embora a micro-irradiação simultânea de muitas células em um determinado FOV seja possível, o sistema de imagem precisará de mais tempo para executar a tarefa. Portanto, medir a dinâmica das proteínas que recrutam muito rapidamente para lesões de DNA limita o número de possíveis ROIs para micro-irradiação utilizada simultaneamente. No sistema de imagem usado para este protocolo, a microdiadistração de um único ROI de 1024 pixels de comprimento leva 1032 ms usando 1000 μs de tempo de moradia e 3088 ms usando 3000 μs tempo de moradia para completar. O uso de várias linhas de ROIs aumentará significativamente o tempo necessário para terminar a micro-irradiação (por exemplo, ROI de 7 x 1024 pixels leva 14402 ms usando 1000 μs de tempo de moradia e 21598 ms usando 3000 μs de tempo de moradia). Este tempo é perdido pela aquisição de imagens e deve ser levado em consideração. Ao fotografar eventos rápidos de recrutamento, use o ROI mais curto possível e apenas micro-irradie uma célula de cada vez.
Vantagens e limitações sobre métodos de sincronização
Para estudos específicos do ciclo celular, os métodos existentes envolvem a sincronização das células em fases específicas de ciclo celular ou o uso de repórteres fluorescentes para identificar a fase específica do ciclo celular da célula. No entanto, cada um desses métodos fornece seus próprios desafios e limitações.
O sistema FUCCI3 (contando com as formas truncadas de proteína fluorescente de CDT1 e Geminin) é uma ferramenta particularmente útil para estudos de ciclo celular, mas tem limitações quando se trata de diferenciar entre as fases S e G2 do ciclo celular. Os níveis geminianos já estão altos desde a fase S média e permanecem altos até a fase M, dificultando a separação dessas fases. O uso do sistema FUCCI também significa que dois canais ópticos do microscópio não podem ser usados para a imagem do POI.
As linhas celulares não cancerígenas podem ser sincronizadas em G0 pela remoção de fatores de crescimento encontrados no soro (fome de soro) causando pouco ou nenhum dano de DNA às células. No entanto, a maioria das linhas de células cancerígenas continuará parcialmente progredindo através do ciclo celular, mesmo sem quantidades adequadas de soro em seus meios de comunicação. Além disso, as células começam parcialmente a perder a sincronização pelo G1 final, fase S inicial. Além da fome de soro, existem inúmeros métodos químicos para alcançar a sincronização do ciclo celular. Blocos de hidroxiureia, afiicolina e timidina são métodos de parar a replicação do DNA para sincronizar as células na fase S primitiva. Embora esses métodos sejam baratos e simples, eles introduzem estresse de replicação que resulta em danos ao DNA. Estes inibidores de replicação de DNA têm sido mostrados para induzir a fosforilação de H2A. X, um marcador bem conhecido de DSBs2,29. O método de usar o PCNA marcado como um marcador para células da fase S reduz o potencial para artefatos causados pela sincronização química e pode ser aplicado a uma ampla gama de linhas celulares em comparação com a fome de soro.
Conclusão
O dano ao DNA é uma força motriz para doenças genéticas onde lesões mutagênicas podem levar à transformação maligna das células. Direcionar o maquinário de síntese de DNA é uma estratégia terapêutica fundamental no tratamento de doenças hiperproliferativas como o câncer. Para tratar essas doenças de forma mais direcionada, precisamos de uma melhor compreensão das proteínas que reparam lesões de DNA. O protocolo descrito aqui ajuda estudos baseados em micro-irradiação na fase S, minimizando os desafios apresentados pelos métodos tradicionais de sincronização para reduzir possíveis artefatos e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a M. Pagano por seu apoio contínuo, bem como D. Simoneschi, A. Marzio e G. Tang por sua revisão crítica do manuscrito. B. Miwatani-Minter agradece R. Miwatani e B. Minter por seu apoio contínuo. G. Rona agradece K. Ronane Jurasz e G. Rona pelo apoio contínuo.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
| Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
| BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
| Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
| DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
| EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
| EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
| HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
| McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
| mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
| mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
| Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
| Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
| Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
| Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
| Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
| Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
| NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
| Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
| Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
| Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
| pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
| PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
| polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
| pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
| pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
| pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
| Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
| Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
| U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
| VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |
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