Bu protokol, lazer mikro ışınlama ile DNA onarım proteini alımını ölçmek gibi aşağı akış mikroskopi çalışmaları için S faz hücrelerini verimli bir şekilde tanımlamak için invaziv olmayan bir yöntemi açıklar.
DNA hasarı onarımı, oldukça reaktif bir ortamda hücrelerin genetik bütünlüğünü korur. Hücreler, metabolik aktiviteler veya UV radyasyon gibi hem endojen hem de eksojen kaynaklar nedeniyle çeşitli DNA hasarı türleri biriktirebilir. DNA onarımı olmadan, hücrenin genetik kodu tehlikeye girer, proteinlerin yapılarını ve işlevlerini baltalar ve potansiyel olarak hastalığa neden olur.
Çeşitli hücre döngüsü aşamalarında farklı DNA onarım yollarının mekansal dinamiklerini anlamak, DNA hasarı onarımı alanında çok önemlidir. Mevcut floresan mikroskopi teknikleri, DNA hasarı indüksiyonu sonrası farklı onarım proteinlerinin işe alım kinetiğini ölçmek için harika araçlar sağlar. Hücre döngüsünün S evresi sırasında DNA sentezi, DNA onarımı ile ilgili hücre kaderinde tuhaf bir noktadır. Tüm genomun hatalarını taramak için benzersiz bir pencere sağlar. Aynı zamanda, DNA sentez hataları, bölünmeyen hücrelerde karşılaşılmayan DNA bütünlüğü için de bir tehdit oluşturur. Bu nedenle, DNA onarım süreçleri S fazında hücre döngüsünün diğer aşamalarına göre önemli ölçüde farklılık gösterir ve bu farklılıklar yekçe anlaşılamaz.
Aşağıdaki protokol, 405 nm lazer hattı ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskobu kullanılarak, hücre hatlarının hazırlanmasını ve yerel olarak indüklenen DNA hasar bölgelerinde S fazında DNA onarım proteinlerinin dinamiklerinin ölçüldüklerini açıklar. Etiketli PCNA (mPlum ile), S fazında DNA hasarı alımını ölçmek için acgfp etiketli bir onarım proteini (yani EXO1b) ile birlikte bir hücre döngüsü işaretleyicisi olarak kullanılır.
Hücrelerde ortaya çıkabilecek farklı DNA lezyonlarını ele almak için çeşitli DNA onarım yolları gelişti ve bunların hepsi hem uzayda hem de zamanda son derece düzenlenmiştir. Hücre döngüsünün en savunmasız dönemlerinden biri DNA sentezinin gerçekleştiği S fazıdır. Çoğalma yaşam için temel olsa da, aynı zamanda büyük bir zorluk sağlar. Hücrelerin, mutasyonların gelecek nesillere aktarılabilmesi için genomlarının sadık bir şekilde çoğaltılmasını sağlamaları gerekir. Sonuç olarak, çoğalma onkoloji alanında terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için kullanılan terapötik bir müdahale noktası sağlar.
DNA lezyonlarında protein alımını incelemek için kullanılan tüm ana tekniklerin güçlü ve sınırlamaları vardır. Mikro ışınlama, iyonlaştırıcı radyasyon kaynaklı odakların (IRIF), kromatin-immünoreipitasyonunun (ChIP) veya biyokimyasal fraksiyonasyonun immünofluoresan görüntülemesi gibi alternatif yöntemlerin çoğundan daha iyi mekansal ve zamansal çözünürlük1’e sahiptir. Bununla birlikte, mikro ışınlama, aynı anda çok sayıda hücreyi örnekleyebilen yukarıda belirtilen tekniklerin sağlamlığını sağlar.
S fazında DNA onarımını araştırmak için, zaman uyumsuz hücre kültürü popülasyonundaki S faz hücrelerini ayırt edebilmek gerekir. Bunu ele almak için, hücrelerin senkronizasyonunu veya farklı hücre döngüsü aşamalarının görselleştirilmesini içeren birçok iyi bilinen yöntem vardır. Bununla birlikte, her iki yaklaşım da önemli zorluklar ve olası eserler ortaya koyuyor. Erken S fazında hücreleri zenginleştirmek için yaygın olarak kullanılan kimyasal senkronizasyon yöntemleri (örneğin, çift timidin bloğu, afidikolin ve hidroksiüre tedavisi) replikasyon stresinin indüksiyonu ile senkronizasyon elde eder ve sonunda DNA hasarının kendisi. Bu, S faz2’dekiDNA onarım süreçlerini incelemek için bu yöntemlerin kullanımını sınırlar. Serum açlığı ve salınımı yoluyla senkronizasyon sadece sınırlı sayıda hücre hattı için geçerlidir, büyük ölçüde dönüştürülmemiş hücre hatlarına kıyasla hücre döngüsü ilerlemesi için büyüme faktörlerine daha az dayanan kanser hücre hatları hariç. Floresan Ubiquitin Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) sistemi hücre döngüsünü incelemek için özellikle yararlı bir araçtır, ancak S ve G2 hücre döngüsü aşamaları arasında ayrım yaparken temel bir sınırlamaya sahiptir3.
Burada, S fazı için invaziv olmayan bir işaretleyici olarak floresan etiketli PCNA kullanmanın, kimyasal hücre döngüsü senkronizasyon yöntemlerinin dezavantajlarını sınırlarken, FUCCI sisteminden daha fazla özgüllük ve esneklik sağladığını gösterilmiştir. Tek bir işaretleyici olarak, PCNA sadece zaman uyumsuz bir popülasyondaki S faz hücrelerini vurgulamakla kalmaz, aynı zamanda S fazı içindeki hücrelerin tam ilerlemesini de gösterebilir (yani, erken, orta veya geç S fazı)4. Eksojen, etiketli PCNA’nın düşük ekspresyon seviyeleri, hem hücre döngüsü ilerlemesi hem de DNA onarım süreçlerine minimum parazit sağlar. Daha da önemlisi, PCNA ayrıca birkaç DNA lezyonunun onarımında yer aldığı ve lokal olarak indüklenen DNA hasar bölgelerine1,4.
Burada sunulan deneyler, S aşamasında EXO1b’nin işe alım dinamiklerinin nasıl ölçüldüğini ve bunun köklü PARP inhibitörü olaparib’den nasıl etkilendiğini göstermektedir. EXO1b nükleaz aktivitesi, uyuşmazlık onarımı (MMR), nükleotid eksizyon onarımı (NER) ve çift iplikli kırılma (DSB) onarımı dahil olmak üzere çok çeşitli DNA onarım yolları ile ilgilidir. S fazında EXO1b, DNA rezeksiyonu sırasında 3′ ssDNA çıkıntlarının oluşumu yoluyla homolog rekombinasyonda (İK) önemli bir rol oynar5. EXO1b, replikasyonda iplikçik yer değiştirmesi sırasında gecikmeli iplikçikte astar kaldırma ve Okazaki parça olgunlaşmasının yanı sıra durmuş DNA çatallarını yeniden başlatmak için kontrol noktası aktivasyonundaki rollerle DNA replikasyonuna daha da karışmıştır5. Hasarlı DNA bölgelerine EXO1b alımı poli (ADP-riboz) (PAR)6,7ile doğrudan etkileşim ile düzenlenir. EXO1b’nin çok sayıda hücre döngüsüne özgü etkileri nedeniyle, PCNA kullanarak S fazı spesifik işe alım çalışmaları için mükemmel bir seçimdir.
Kritik adımlar ve olası protokol sorun giderme/değişiklikleri
Mikro ışınlama için uygun doku kültürü damarı başarı için kritik öneme sahiptir. Çoğu yüksek çözünürlüklü görüntüleme sistemi 0,17 mm kapak camı kalınlığı için optimize edilmiştir. Daha yüksek veya daha düşük kalınlıklı görüntüleme odaları veya plastik polimerlerden yapılmış olanları (405 nm görüntüleme için optimize değildir) kullanmak görüntü kalitesini önemli ölçüde azaltabilir. Cam yüzeyleri kullanırken, hücre yapışmasını arttırmak için doku kültürüne göre işlem gördüğünden emin olun. Doku kültürü tedavi edilmezse, bu odaların, örneğin hücrelerin tohumlamadan önce poli-D lizin ile kaplanması gerekecektir. Hücreleri odalı örtü örtüsüne kaplarken, hücre döngüsü düzensizliklerini ve hücrelere ek stresi önlemek için ideal hücre yoğunluğu çok önemlidir. Kararlı bir sıcaklığı korumak için deneyden önce mikroskop bileşenlerinin uygun termal dengelenmesi, hem odağın zaman atlamalı görüntüleme boyunca korunması için çok önemlidir hem de zaman ve numuneler arasında homojen bir DDR sağlamak için de gereklidir.
Artekter verileri azaltmak için hücrelerin mikro ışınlamadan önce sağlıklı bir durumda olması önemlidir. Hücrelerin enfeksiyon sonrası/seçim sonrası düzensiz morfolojisi varsa, morfoloji normale dönene kadar hücrelerin birden fazla geçitten ilerlemesine izin verin. Her zaman kullanılan hücre hatlarının mikoplazma kontaminasyonundan arındırılmış olduğundan emin olun. Mikoplazma enfeksiyonunun birçok olumsuz etkisi arasında, konak hücrelerde DNA hasarına neden olur ve DDR yollarını etkileyebilir14,15. Hücre kültüründe mikoplazmayı tespit etmenin en hassas yolu PCR ‘dir (DAPI veya Hoechst ile algılamaya karşı).
İlgi çekici onarım proteininin optimal aşırı ekspresyonu, endojen seviyelerle karşılaştırılabilir, ancak tespit için yeterince yüksek olmalıdır. Viral vektörlerde kullanılan promotör, enfeksiyon sırasında viral titre ve enfeksiyon süresinin uzunluğu ideal ifade seviyeleri için ayarlanabilir. Tutarlı sonuçlar için, homojen ifade düzeylerini ve normal hücre morfolojisini sağlamak için tek tek hücre klonlarını izole edin. Uygun hücre döngüsü ve DNA onarım işaretleyici işlevi için etiketli PCNA’yı endojen seviyelerden daha yüksek bir seviyede aşırı ifade etmeyen vektör yapılarının kullanılması önerilir. Düşük PCNA aşırı ifade seviyeleri bile S faz hücrelerini ayırt etmek için yeterlidir. Retroviral pBABE vektörleri bu amaçla başarıyla kullanılmıştır (Addgene #1764, #1765, #1766, #1767). PCNA, herhangi bir monomerik kırmızı(örneğin, mPlum, mCherry, mRuby, vb.) veya monomerik yeşil floresan proteinlerle (örneğin, mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald, vb.) etiketlenebilir ve daha sonra dönüşümlü olarak etiketlenmiş bir POI ile birleştirilebilir. Floresan etiketli bir İçN’yi aşırı ifade etmenin bazı sınırlamaları ve dikkat edilmesi gereken noktalar vardır. Floresan etiketler normal protein fonksiyonunu ve lokalizasyonunu bozabilir. Bu nedenle, etiketin konumu (N veya C terminali) dikkate alınmalıdır. Monomerik olmayan varyantların oligomerizasyonu İçN’nin işlevini etkileyebileceğinden, her zaman monomerik floresan proteinler kullanın.
Optik yolun birçok bileşeni hücrelere teslim edilen gerçek gücü etkileyeceğinden, lazer ayarları her görüntüleme sistemi için belirlenmelidir. Lazer mikro ışınlama, heyecan dalga boyuna, FRAP lazerinin güç çıkışına ve önceden duyarlı ajanların (Bromodeoxyuridine veya Hoechst gibi) kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak çeşitli DNA lezyonlarına neden olabilir. 405 nm lazerler oksidatif DNA hasarına neden olabilir, tek ve çift iplikli kırılmalar16,17. Daha yüksek lazer çıkış ayarları kullanılarak, DSB miktarı artar. Bu protokolde ön duyarlılık yöntemleri kullanılmamıştır, ancak bu teknikler literatürde büyük ölçüde ele alınmıştır ve aşağıdaki tartışmada yeniden kaplanmıştır. Bize göre, istenen lezyonun üretilip üretilmemelerini test etmenin en iyi yolu, bilinen DNA hasar yolu spesifik genlerinin işe alımını test etmektir. BER yolunun bileşenleri olan NTHL1 veya OGG1’in işe alınması, oksitlenmiş DNA bazları10 , 11,17,18,19’unindüksiyonunu önerirken, FBXL10 veya XRCC5 DSB 8 ,20,21’invarlığını gösterir. XRCC1’in işe alımı hem oksitlenmiş DNA bazlarının varlığını hem de tek iplikli kırılmaları (SSB)22,23gösterebilir. XPC (yani RAD4), ultraviyole ışık (UV)17,24tarafından üretilen hacimli DNA eklerini kaldıran iyi bir NER göstergesidir. Eksojen proteinlerin işe alınması bazı düzensizliklere neden olabileceğinden, endojen DNA onarım proteinlerinin veya belirteçlerinin immünofluoresan lekelenmeleri (çift iplikli molalar için φH2A.X gibi) spesifik DNA lezyonlarının varlığını doğrulayabilir. Alternatif olarak, belirli DNA lezyonlarına karşı yetiştirilen antikorlar da kullanılabilir. Teslim edilen lazer gücünü ayarlamak için hem durma süresi hem de lazer gücü değiştirilebilir.
Matematiksel modelleme yardımıyla, İçN’nin işe alım özellikleri hakkında değerli içgörüler sağlayabilecek ayrıntılı bir kinetik analiz yapılabilir (örneğin, birden fazla DNA bağlayıcı etki alanının katkısı, farklı sinyal olaylarına duyarlılık vb.). Otomatik işe alım değerlendirmesi ve hücre takibi, sağlam iş akışları oluşturmak için birleştirilebilir 1,25.
DNA ön duyarlılığının avantajları ve sınırlamaları
Mikro ışınlamadan önce DNA’nın önceden duyarlı hale getirilmesi, DNA onarım proteini alımı için yaygın olarak kullanılan bir araçtır16,17. Dna’yı mikro ışınlamadan önce hassaslaştırmak DSB’lere karşı daha hassas hale gelir. DNA ön duyarlılığı için en yaygın iki yöntem Bromodeoxyuridine (BrdU) veya Hoechst boyası ile hücrelerin ön tedavisidir. Yüksek lazer güçlerinde mikro ışınlama yapamayan sistemler için, bu yöntemler DSB’ler gibi DNA lezyonlarını indükleme için gerekli olabilir. Ayrıca, iletilen bir ışık dedektörünün veya hücre çekirdeğini vurgulayan bir floresan sinyalin yokluğunda (örneğin, etiketlenmemiş endojen DNA onarım proteinlerinin alımını incelerken), Hoechst hem önceden hassaslaştırıcı bir araç hem de floresan bir nükleer leke görevi görür. Bununla birlikte, DNA ön duyarlılığı önemli komplikasyonlar ortaya getirebilir. BrdU (10 μM’lik son konsantrasyonda kullanılır), DNA’ya düzgün bir şekilde dahil olmak için hücrelere 24 saat (veya kullanılan hücre hattındaki tam hücre döngüsüne eşdeğer bir süre) eklenmelidir ve hücre döngüsü parazitine neden olabilir26. Hoechst 33342 (1 μg/mL’lik son konsantrasyonda kullanılır) uzun kuluçka dönemlerinden sonra sitotoksiktir, ancak çekirdeği boya ile doyurmak için yeterli zaman gerektirir. Bu nedenle, mikro ışınlamadan sadece 15-20 dakika önce uygulanmalıdır; aksi takdirde, işe alım verileri tutarlı olmayacaktır. Bu şekilde boyanmış hücreler birkaç saatten fazla kültürde tutulamaz27,28. Hoechst 33342 boyası kadar hücre geçirgen olmayan Hoechst 33358’i kullanmamaya dikkat edin. Ön duyarlılık ayrıca deneyler arasında gereksiz farklılıklar ortaya çıkarır ve deneyi hücre yoğunluğundaki farklılıklara karşı daha da hassas hale getirir (çünkü bu, birikmiş boya / hücre miktarını etkileyecektir).
Konfokal mikroskopinin avantajları ve sınırlamaları
Konfokal mikroskopinin görüntüleme hızı geniş alan mikrokroskopisi ile karşılaştırıldığında sınırlayıcı olabilir. Bununla birlikte, rezonans tarayıcı ile donatılmış bir konfokal mikroskop, dönen disk mikroskopi hızlarına yaklaşan görüntüleme hızını (çözünürlük pahasına) inanılmaz derecede artırabilir. Üç özellik, A1R HD25 konfokal sistemi burada sunulan protokol için mükemmel bir seçim haline getirir. İlk olarak, sistemin 25 mm FOV’u, tek bir taranmış alanda (normal kurulumlarda 5-10 hücreye karşı) 15-20 hücre arasında görüntü oluşturmayı mümkün kılar ve istatistiksel analiz için yeterli hücre elde etmek için gerekli kazanım sayısını sınırlar. İkincisi, FRAP modülü ve iki scanhead, hücreleri yalnızca ardışık olarak değil, aynı anda görüntülemeyi ve mikro ışınlanmayı mümkün kılır. Son olarak, hem rezonans hem de galvano tarayıcılara sahip olma esnekliği, floroforların söndürülmesine en aza indiren olağanüstü hıza sahip yüksek zamansal çözünürlüklü görüntüleme ile daha yüksek sinyal-gürültü oranına sahip görüntüler üretmek için daha yavaş tarama hızlarını kullanan yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme arasında kolayca geçiş yapma olanağı sağlar. Kullanılan sistem yukarıda belirtilen esnekliğe izin verirken, daha yaygın olarak bulunan konfokal mikroskop konfigürasyonlarına benzemesi için, sunulan deneylerde (hem mikro ışınlama hem de sonraki görüntüleme için) sadece galvano tarayıcı kullanılmıştır.
Mikro ışınlamanın avantajları ve sınırlamaları
Mikro ışınlama rakipsiz mekansal ve zamansal çözünürlük sağlarken, sınırlamasız değildir. Lazer mikro ışınlama ile DNA hasarı, doğal olarak meydana gelen zarar verici ajanlara kıyasla çekirdeğin belirli bölgelerine yüksek oranda kümelenmiştir. Bu nedenle, mikro ışınlama nedeniyle kromatin yanıtı homojen olarak dağıtılmış hasara göre farklılık gösterebilir. Ek olarak, mikro ışınlama zaman alıcıdır ve sadece birkaç düzine hücre üzerinde yapılabilirken, büyük popülasyon bazlı biyokimyasal yöntemler (kromatin fraksiyonasyonu, immün önkoşulasyon, ChIP) aynı anda binlerce hücreyi inceleyerek daha fazla sağlamlık sağlayabilir. Mikro ışınlama ile yapılan gözlemlerin geleneksel biyokimyasal tekniklerle doğrulanması güvenilir sonuçlar için etkili bir stratejidir. Belirli bir FOV’daki birçok hücrenin aynı anda mikro ışınlanması mümkün olsa da, görüntüleme sisteminin görevi yerine getirmek için daha fazla zamana ihtiyacı olacaktır. Bu nedenle, DNA lezyonlarına çok hızlı bir şekilde katılan proteinlerin dinamiklerinin ölçülmesi, aynı anda kullanılan mikro ışınlama için olası ROI sayısını sınırlar. Bu protokol için kullanılan görüntüleme sisteminde, tek bir 1024 piksel uzunluğundaki yatırım getirisinin mikro ışınlanması, 1000 μs bekleme süresi kullanılarak 1032 ms ve tamamlanması için 3000 μs bekleme süresi kullanılarak 3088 ms sürer. Birden fazla ROI satırı kullanmak mikro ışınlamayı bitirmek için gereken süreyi önemli ölçüde artıracaktır (örneğin, 7 x 1024 piksel uzunluğunda yatırım getirisi, 1000 μs bekleme süresi kullanarak 14402 ms ve 3000 μs bekleme süresi kullanarak 21598 ms sürer). Bu süre görüntü alımından kaybolur ve dikkate alınmalıdır. Hızlı işe alım olaylarını görüntülerken, mümkün olan en kısa yatırım getirisini kullanın ve aynı anda yalnızca bir hücreyi mikro ışınlayın.
Senkronizasyon yöntemlerine göre avantajlar ve sınırlamalar
Hücre döngüsüne özgü çalışmalar için, mevcut yöntemler ya hücrelerin belirli hücre döngüsü aşamalarına eşitlenmesini ya da hücrenin belirli hücre döngüsü aşamasını tanımlamak için floresan muhabirlerin kullanılmasını içerir. Ancak, bu yöntemlerin her biri kendi zorluklarını ve sınırlamalarını sağlar.
FUCCI sistem3 (CDT1 ve Geminin floresan protein etiketli kesilmiş formlarına dayanarak) hücre döngüsü çalışmaları için özellikle yararlı bir araçtır, ancak hücre döngüsünün S ve G2 aşamaları arasında ayrım yapma konusunda sınırlamaları vardır. Geminin seviyeleri zaten orta S fazından yüksektir ve M fazı olana kadar yüksek kalır, bu da bu aşamaların ayrılmasını zorlaştırır. FUCCI sisteminin kullanılması, İçN’yi görüntülemek için mikroskobun iki optik kanalının kullanılamayacağı anlamına da gelir.
Kanser dışı hücre hatları, serumda bulunan büyüme faktörlerinin (serum açlığı) uzaklaştırılmasıyla G0’ye senkronize edilebilir ve hücrelerde çok az DNA hasarına neden olabilir veya hiç DNA hasarına neden olmaz. Bununla birlikte, çoğu kanser hücresi hattı, ortamlarında yeterli miktarda serum olmasa bile hücre döngüsü boyunca kısmen ilerlemeye devam edecektir. Ayrıca, hücreler G1’in sonlarına, erken S aşamasına kadar senkronizasyonu kısmen kaybetmeye başlar. Serum açlığı ek olarak, hücre döngüsü senkronizasyonu elde etmek için çok sayıda kimyasal yöntem vardır. Hidroksiüre, aphidicolin ve timidin blokları, hücreleri erken S fazına senkronize etmek için DNA replikasyonunu durdurma yöntemleridir. Bu yöntemler ucuz ve basit olsa da, DNA hasarına neden olan çoğaltma stresi ortaya çıkarandır. Bu DNA replikasyon inhibitörlerinin H2A’nın fosforilasyonunun indüklendiğini göstermiştir. X, DSBs 2,29’uniyi bilinen bir işareti. S fazlı hücreler için bir işaretleyici olarak etiketli-PCNA kullanma yöntemi, kimyasal senkronizasyonun neden olduğu eserler için potansiyeli azaltır ve serum açlığına kıyasla çok çeşitli hücre hatlarına uygulanabilir.
Son
DNA hasarı, mutajenik lezyonların hücrelerin kötü huylu dönüşümüne yol açabileceği genetik hastalıklar için itici bir güçtür. DNA sentez makinelerinin hedeflenmesi, kanser gibi hiperproliferatif hastalıkların tedavisinde temel bir terapötik stratejidir. Bu hastalıkları daha hedefli bir şekilde tedavi etmek için DNA lezyonlarını onaran proteinlerin daha iyi anlaşılmasına ihtiyacımız vardır. Burada açıklanan protokol, olası eserleri azaltmak ve deneylerin tekrarlanabilirliğini artırmak için geleneksel senkronizasyon yöntemlerinin sunduğu zorlukları en aza indirerek S aşamasında mikro ışınlama tabanlı çalışmalara yardımcı olur.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar M. Pagano’ya sürekli desteği için ve D. Simoneschi, A. Marzio ve G. Tang’a makaleyi eleştirel incelemeleri için teşekkür eder. B. Miwatani-Minter, R. Miwatani ve B. Minter’e sürekli destekleri için teşekkür ediyor. G. Rona, K. Ronane Jurasz ve G. Rona’ya sürekli destekleri için teşekkür ediyor.
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |