Trowell Tipi Organ Kültürünün Diş Kök Hücrelerinin Düzenlenmesini Incelemek İçin Kullanılması
Summary
Trowell tipi organ kültürü yöntemi, diş gelişimini yöneten karmaşık sinyal ağlarını çözmek ve daha yakın zamanlarda, sürekli büyüyen fare kesici dişinin kök hücrelerinde yer alan düzenlemeleri incelemek için kullanılmıştır. Floresan muhabir hayvan modelleri ve canlı görüntüleme yöntemleri, dental kök hücrelerin ve bunların spesifik niş mikro çevrelerinin derinlemesine analizini kolaylaştırır.
Abstract
Organ gelişimi, işlevi ve yenilenmesi, kök hücre nişleri adı verilen ayrı anatomik boşluklarda bulunan kök hücrelere bağlıdır. Sürekli büyüyen fare kesici dişi, dokuya özgü kök hücreleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. Kesici dişin epitel dokusuna özgü kök hücreleri, dişin proksimal ucunda, servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur. Dişin kendiliğinden keskinleşen ucunun sürekli aşınmasını dengelemek için sürekli bir hücre akışı sağlarlar. Burada, kök hücreleri ve nişlerini barındıran fare kesici dişinin proksimal ucunun izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu, doku parçalarının (eksplantlar) in vitro kültürünün yanı sıra metal bir ızgara tarafından desteklenen bir filtre üzerindeki sıvı/hava arayüzündeki kalın doku dilimlerini sağlayan modifiye edilmiş bir Trowell tipi organ kültürü protokolüdür. Burada açıklanan organ kültürü protokolü , in vivo olarak mümkün olmayan doku manipülasyonlarına olanak tanır ve floresan muhabir (ler) in kullanımı ile birleştirildiğinde, kök hücreler de dahil olmak üzere zaman içinde canlı dokulardaki ayrık hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izlenmesi için bir platform sağlar. Bu sistemde çeşitli düzenleyici moleküller ve farmakolojik bileşikler, kök hücreler ve nişleri üzerindeki etkileri açısından test edilebilir. Bu sonuçta kök hücre düzenleme ve bakımını incelemek için değerli bir araç sağlar.
Introduction
Fare kesici dişleri, diş bileşenlerinin kesintisiz üretimini destekleyen kök hücrelerin (SC) ömür boyu korunması nedeniyle sürekli büyür. Bunlar, diğer hücrelerin yanı sıra emaye üreten ameloblastlar üreten epitel SC’leri ve dentin üreten odontoblastlar üreten mezenkimal kök hücreleri (MSC’ler) içerir1. Sürekli büyüyen kesici dişlerdeki epitel SC’leri başlangıçta etiket tutucu hücreler 2,3 olarak tanımlandı ve o zamandan beri Sox24 de dahil olmak üzere bir dizi iyi bilinen kök genini ifade ettiği gösterildi. Bu hücreler, diğer organlardaki epitel SC’leri ile ortak özellikleri paylaşır ve kesici dişin labial tarafında bulunan servikal döngü adı verilen SC nişi içinde bulunur. Niş, SC aktivitesini kontrol eden hücrelerden ve hücre dışı matristen oluşan dinamik bir varlıktır5. Soy izleme çalışmaları, Sox2+ epitel SC’lerinin dişin tüm epitel bölmesini yenileyebildiğini ve ardışık diş oluşumu için çok önemli olduğunu göstermiştir 6,7. Dentin onarıcı veya rejeneratif potansiyeli olan MSC’ler büyük ölçüde organ dışından kan damarları ve sinirler yoluyla işe alınır 8,9,10,11, bu nedenle MSC popülasyonunun işe alımını, göçünü ve barınmasını incelemek için uygun bir model sağlar.
SC’leri in vivo olarak incelemek her zaman mümkün değildir, çünkü genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonların çoğu organ homeostazını etkileyebilir ve / veya ölümcül sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, organ kültürü, SC’lerin ve nişlerinin in vitro olarak düzenlenmesini incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Metal bir ızgara kullanan organ kültürü sistemi başlangıçta organ gelişimini incelemek için Trowell12 tarafından geliştirildi ve böbrek gelişiminde endüktif sinyalleri incelemek için Saxen13 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, organın tamamını veya bir kısmını kültürlemek için bu in vitro yöntem, farklı alanlarda başarıyla uygulanmıştır. Diş gelişimi alanında, bu yöntem diş gelişimini yöneten epitel-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır14 ve ardışık diş oluşumu15. Thesleff laboratuvarının çalışması, bu sistemin diş büyümesi ve morfogenezinin zamansal analizi, çeşitli moleküllerin ve büyüme faktörlerinin diş büyümesi üzerindeki etkisinin analizi ve diş gelişiminin hızlandırılmış canlı görüntülenmesi için faydasını göstermiştir16,17. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem kesici SC’lerin ve burada ayrıntılı olarak açıklanan niş18,19’un düzenlenmesini incelemek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İn vitro organ kültürü, organ büyümesini ve morfogenezi yöneten endüktif potansiyeli ve epitelyal-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Thesleff laboratuvarı, Trowell tipi organ kültürünün Saxén modifikasyonunun nasıl uyarlanacağını ve diş gelişimini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiştir14. Floresan muhabirlerindeki tekrarlanabilir koşullar ve ilerlemeler, bunu diş morfogenezini ve içindeki farklı hücre po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D’Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
