שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים
Summary
שיטת תרבית האיברים מסוג טרוול שימשה לפענוח רשתות איתות מורכבות השולטות בהתפתחות השיניים, ולאחרונה לחקר הוויסות המעורב בתאי גזע של חותך העכבר הגדל ללא הרף. מודלים של בעלי חיים מדווחים פלואורסצנטיים ושיטות הדמיה חיה מאפשרים ניתוח מעמיק של תאי גזע דנטליים ושל המיקרו-סביבה הנישה הספציפית שלהם.
Abstract
התפתחותם, תפקודם והתחדשותם של איברים תלויים בתאי גזע, השוכנים בתוך מרחבים אנטומיים בדידים הנקראים נישות תאי גזע. חותך העכבר הגדל ללא הרף מספק מודל מצוין לחקר תאי גזע ספציפיים לרקמות. תאי הגזע הספציפיים לרקמת האפיתל של החותך ממוקמים בקצה הפרוקסימלי של השן בנישה הנקראת לולאת צוואר הרחם. הם מספקים זרם מתמשך של תאים כדי לאזן את השחיקה המתמדת של קצה ההשחזה העצמית של השן. מוצג כאן פרוטוקול מפורט לבידוד ולתרבית של הקצה הפרוקסימלי של חותך העכבר המכיל תאי גזע ונישתם. זהו פרוטוקול תרבית איברים שונה מסוג Trowell המאפשר תרבית in vitro של חתיכות רקמה (explants), כמו גם את פרוסות הרקמה העבות בממשק נוזל/אוויר על מסנן הנתמך על ידי רשת מתכת. פרוטוקול תרבית האיברים המתואר כאן מאפשר מניפולציות רקמה שאינן ניתנות לביצוע in vivo , ובשילוב עם שימוש בכתב(ים) פלואורסצנטיים, הוא מספק פלטפורמה לזיהוי ומעקב אחר אוכלוסיות תאים בדידים ברקמות חיות לאורך זמן, כולל תאי גזע. ניתן לבדוק במערכת זו מולקולות רגולטוריות שונות ותרכובות פרמקולוגיות להשפעתן על תאי גזע ועל הנישות שלהם. זה בסופו של דבר מספק כלי רב ערך לחקר ויסות ותחזוקה של תאי גזע.
Introduction
החותכות של העכברים גדלות ברציפות הודות לשימור לכל החיים של תאי הגזע (SC) התומכים בייצור בלתי פוסק של רכיבי השן. אלה כוללים SCs אפיתל, אשר מייצרים אמלובלסטים המייצרים אמייל, ותאי גזע מזנכימליים (MSCs), אשר מייצרים אודונטובלסטים המייצרים דנטין, בין תאים אחרים1. ה-SCs האפיתליאליים בחותכות הגדלות ברציפות זוהו בתחילה כתאים שומרי תווית2,3 ומאז הוכחו כמבטאים מספר גני גזע ידועים, כולל Sox24. תאים אלה חולקים תכונות משותפות עם SCs אפיתל באיברים אחרים ושוכנים בתוך נישה SC הנקראת לולאת צוואר הרחם הממוקמת בצד הלאברי של החותך. הנישה היא ישות דינמית המורכבת מתאים ומטריצה חוץ-תאית השולטים בפעילות SC5. מחקרי מעקב אחר שושלת הראו כי Sox2+ אפיתל SCs יכול לחדש את כל תא האפיתל של השן וכי הם חיוניים ליצירת שןרציפה 6,7. MSCs עם פוטנציאל תיקון או התחדשות של דנטין מגויסים ברובם מחוץ לאיבר דרך כלי דם ועצבים 8,9,10,11, ולכן, מספקים מודל מתאים לחקר גיוס, הגירה ודיור של אוכלוסיית MSC.
מחקר SCs in vivo אינו תמיד אפשרי, שכן רבות מהמניפולציות הגנטיות ו / או הפרמקולוגיות יכולות להשפיע על הומאוסטזיס איברים ו / או להיות בעלות השלכות קטלניות. לכן, תרבות איברים מספקת כלי מצוין לחקר הרגולציה של SCs ואת הנישות שלהם במבחנה. מערכת תרבית האיברים המשתמשת ברשת מתכת פותחה בתחילה על ידי Trowell12 כדי לחקור את התפתחות האיברים ושונתה עוד יותר על ידי Saxen13 כדי לחקור אותות אינדוקטיביים בהתפתחות הכליות. מאז, שיטה זו במבחנה של culturing את כל או חלק של האיבר כבר מיושם בהצלחה בתחומים שונים. בתחום התפתחות השן, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור את האינטראקציות אפיתליאליות-מזנכימליות השולטות בהתפתחות השן14 והיווצרות שן עוקבת15. עבודתה של מעבדת Thesleff הדגימה את התועלת של מערכת זו לניתוח זמני של צמיחת שיניים ומורפוגנזה, לניתוח ההשפעה של מולקולות שונות וגורמי גדילה על צמיחת השן, ולהדמיה חיה בהילוך מהיר של התפתחות השן16,17. לאחרונה, שיטה זו שימשה כדי ללמוד רגולציה של SCs חותך ואת הנישה שלהם18,19, אשר מתואר בפירוט כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבית איברים במבחנה שימשה באופן נרחב לחקר פוטנציאל אינדוקטיבי ואינטראקציות אפיתל-מזנכימליות השולטות בגדילת איברים ובמורפוגנזה. מעבדת Thesleff הדגימה כיצד להתאים את שינוי הסקסן של תרבית איברים מסוג טרוול ולהשתמש בה כדי לחקור את התפתחות השיניים14. התנאים הניתנים לשחזור וההת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן ג’יין ואטוס ארקו.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D’Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
