Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen
Summary
Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.
Abstract
Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.
Introduction
Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen1. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene, einschließlich Sox24, exprimieren. Diese Zellen teilen gemeinsame Merkmale mit epithelialen SCs in anderen Organen und befinden sich in der SC-Nische, die als zervikale Schleife auf der labialen Seite des Schneidezahns bezeichnet wird. Die Nische ist eine dynamische Einheit, die aus Zellen und extrazellulärer Matrix besteht, die die SC-Aktivitätsteuern 5. Studien zur Linienverfolgung haben gezeigt, dass Sox2+ epitheliale SCs das gesamte Epithelkompartiment des Zahnes regenerieren können und dass sie für die Sukzessionszahnbildung entscheidend sind 6,7. MSCs mit reparativem oder regenerativem Dentinpotenzial werden größtenteils von außerhalb des Organs über Blutgefäße und Nerven 8,9,10,11 rekrutiert und bieten daher ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Rekrutierung, Migration und Unterbringung der MSC-Population.
Die Untersuchung von SCs in vivo ist nicht immer möglich, da viele der genetischen und/oder pharmakologischen Manipulationen die Organhomöostase beeinträchtigen und/oder tödliche Folgen haben können. Daher bietet die Organkultur ein hervorragendes Werkzeug, um die Regulation von SCs und ihren Nischen in vitro zu untersuchen. Das Organkultursystem, das ein Metallgitter verwendet, wurde ursprünglich von Trowell12 entwickelt, um die Organentwicklung zu untersuchen, und wurde von Saxen13 weiter modifiziert, um induktive Signale in der Nierenentwicklung zu untersuchen. Seitdem wird diese In-vitro-Methode zur Kultivierung des gesamten oder eines Teils des Organs in verschiedenen Bereichen erfolgreich angewendet. Im Bereich der Zahnentwicklung wurde diese Methode häufig verwendet, um die epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Zahnentwicklung14 und die Sukzessionszahnbildung15 steuern. Die Arbeit des Thesleff-Labors hat den Nutzen dieses Systems für die zeitliche Analyse des Zahnwachstums und der Morphogenese, für die Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Zahnwachstum und für die Zeitraffer-Live-Bildgebung der Zahnentwicklung gezeigt16,17. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um die Regulation von Schneidezahn-SCs und ihrer Nische18,19 zu untersuchen, die hier ausführlich beschrieben wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann14. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Jane and Aatos Erkko Foundation unterstützt.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
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