Использование культуры органов типа Trowell для изучения регуляции стоматологических стволовых клеток
Summary
Метод культуры органов типа Троуэлла был использован для разгадки сложных сигнальных сетей, которые управляют развитием зубов, и, в последнее время, для изучения регуляции, связанной со стволовыми клетками постоянно растущего мышиного резца. Флуоресцентно-репортерные животные модели и методы визуализации в реальном времени облегчают углубленный анализ стоматологических стволовых клеток и их конкретной нишевой микросреды.
Abstract
Развитие, функция и регенерация органов зависят от стволовых клеток, которые находятся в дискретных анатомических пространствах, называемых нишами стволовых клеток. Постоянно растущий мышиный резец обеспечивает отличную модель для изучения тканеспецифических стволовых клеток. Эпителиальные тканеспецифические стволовые клетки резца расположены на проксимальном конце зуба в нише, называемой шейной петлей. Они обеспечивают непрерывный приток клеток для уравновешивания постоянного истирания самозатачивающегося кончика зуба. Здесь представлен подробный протокол выделения и культивирования проксимального конца мышиного резца, в котором находятся стволовые клетки и их ниша. Это модифицированный протокол посева органов типа Trowell, который позволяет выращивать in vitro кусочки ткани (экспланты), а также толстые срезы ткани на границе раздела жидкость/воздух на фильтре, поддерживаемом металлической сеткой. Протокол посева органов, описанный здесь, позволяет проводить манипуляции с тканями, невозможные in vivo, и в сочетании с использованием флуоресцентного репортера (репортеров) он обеспечивает платформу для идентификации и отслеживания дискретных популяций клеток в живых тканях с течением времени, включая стволовые клетки. Различные регуляторные молекулы и фармакологические соединения могут быть протестированы в этой системе на предмет их влияния на стволовые клетки и их ниши. Это в конечном итоге обеспечивает ценный инструмент для изучения регуляции и поддержания стволовых клеток.
Introduction
Мышиные резцы непрерывно растут благодаря пожизненному сохранению стволовых клеток (SC), которые поддерживают непрерывное производство компонентов зуба. К ним относятся эпителиальные СК, которые генерируют эмал-продуцирующие амелобласты, и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые генерируют дентин-продуцирующие одонтобласты, среди других клеток1. Эпителиальные СК в непрерывно растущих резцах были первоначально идентифицированы как клетки, удерживающие метку 2,3, и с тех пор было показано, что они экспрессируют ряд хорошо известных генов стволовости, включая Sox24. Эти клетки имеют общие черты с эпителиальными СК в других органах и находятся в нише SC, называемой шейной петлей, расположенной на губной стороне резца. Ниша представляет собой динамическую сущность, состоящую из клеток и внеклеточного матрикса, которые контролируют активность SC5. Исследования по отслеживанию линии показали, что эпителиальные СК Sox2+ могут регенерировать весь эпителиальный компартмент зуба и что они имеют решающее значение для формирования сукцессионного зуба 6,7. МСК с репаративным или регенеративным потенциалом дентина в значительной степени набираются извне органа через кровеносные сосуды и нервы 8,9,10,11, что обеспечивает подходящую модель для изучения вербовки, миграции и жилья популяции MSC.
Изучить СК in vivo не всегда возможно, так как многие генетические и/или фармакологические манипуляции могут влиять на гомеостаз органов и/или иметь летальные последствия. Поэтому органная культура является отличным инструментом для изучения регуляции СК и их ниш in vitro. Система культуры органов, которая использует металлическую сетку, была первоначально разработана Trowell12 для изучения развития органов и была дополнительно модифицирована Saxen13 для изучения индуктивных сигналов в развитии почек. С тех пор этот метод культивирования всего или части органа in vitro успешно применяется в разных областях. В области развития зубов этот метод широко используется для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют развитием зуба14 и сукцессионным формированием зубов15. Работа лаборатории Thesleff продемонстрировала полезность этой системы для временного анализа роста и морфогенеза зубов, для анализа влияния различных молекул и факторов роста на рост зубов, а также для покадровой живой визуализации развития зубов16,17. Совсем недавно этот метод был использован для изучения регулирования резцовых СК и их ниши18,19, которая подробно описана здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Культура органов in vitro широко используется для изучения индуктивного потенциала и эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют ростом органов и морфогенезом. Лаборатория Thesleff продемонстрировала, как адаптировать саксенскую модификацию культуры органов типа Т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Фондом Джейн и Аатоса Эркко.
Materials
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D’Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
