عزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية البالغة عن القشرة الطازجة المجمدة باستخدام فرز النوى المنشطة بالفلور
Summary
لقد طورنا طريقة تثري وتعزل مجموعات الخلايا النجمية البشرية عن الأنسجة المجمدة الطازجة لاستخدامها في التحليلات الجزيئية النهائية.
Abstract
لا يزال تعقيد الخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة البشرية الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها الجزيئي. يمكن استخدام فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) لعزل ودراسة مجموعات النوى العصبية البشرية (NeuN+) بنجاح من الأنسجة الأرشيفية المجمدة ، وبالتالي تجنب المشاكل المرتبطة بالتعامل مع الأنسجة الطازجة. ومع ذلك ، لا توجد جهود لعزل الخلايا الدبقية النجمية بالمثل عن العنصر غير العصبي (NeuN-). تستخدم استراتيجية وضع العلامات المناعية التي تم تطويرها مؤخرا والتي تم التحقق منها ثلاثة أجسام مضادة لعامل النسخ لعزل مجموعات النوى العصبية المخصبة (NeuN+) في وقت واحد من الخلايا النجمية (بروتين الصندوق المقترن 6 (PAX6) + NeuN-) ، وسلف الخلايا قليلة التغصن (OLIG2 + NeuN-) من أنسجة القشرة المخية الجديدة البشرية الصدغية غير المريضة والطازجة (غير الثابتة) المجمدة بعد الوفاة.
وقد تبين أن هذه التقنية مفيدة لتوصيف التغييرات في النسخ الخاصة بنوع الخلية في القشرة المخية الجديدة للصرع المرضي الأساسي. أكدت التحليلات النسخية أن المجموعات المصنفة من PAX6 + NeuN يتم تخصيبها بقوة لعلامات الخلايا النجمية الشاملة والتقاط الخلايا النجمية في كل من ظروف الراحة والتفاعل. تصف هذه الورقة منهجية FANS لعزل مجموعات النوى الغنية بالخلايا النجمية عن القشرة البشرية المجمدة الطازجة ، بما في ذلك تفكك الأنسجة إلى تعليق أحادي النواة (sn) ؛ وضع علامات مناعية على النوى بالأجسام المضادة المضادة ل NeuN و PAX6 المترافقة بالفلورسنت ؛ استراتيجيات بوابات المراوح ومقاييس مراقبة الجودة لتحسين الحساسية والخصوصية أثناء الفرز وتأكيد إثراء الخلايا النجمية ؛ وأوصت بالشراء لتسلسل إمكانية الوصول إلى النسخ النهائي والكروماتين بدقة مجمعة أو sn. ينطبق هذا البروتوكول على العينات القشرية البشرية غير الميتة والمجمدة حديثا مع أمراض مختلفة وجمع الأنسجة الموصى بها بعد الوفاة في غضون 24 ساعة.
Introduction
لا يزال التعقيد الجزيئي للخلايا النجمية البشرية غير محدد بشكل جيد في الأنسجة الأولية ، مما يتطلب أدوات أفضل لعزلها وتوصيفها بدقة عالية ، سواء في الصحة أو المرض. لقد ثبت أن فصل الخلايا العصبية البشرية السليمة والدبقية عن مكانتها أمر صعب بسبب محدودية الوصول إلى عينات أنسجة المخ الجديدة ، والطبيعة المترابطة بشدة للعمليات الدبقية والعصبية ، والتنشيط الخلوي الحتمي أثناء المعالجة ، وكلها تحد من التوصيف الجزيئي لهذه الأنواع من الخلايا خارج الجسم الحي1 . ظهر فرز النوى المنشطة بالفلور (FANS) كبديل لفرز الخلايا الحية ، مما مكن من التفكك ووضع العلامات المناعية لمجموعات النوى من الأنسجة المجمدة. في العقد الماضي ، أصبحت FANS تستخدم على نطاق واسع لعزل وتوصيف مجموعات النوى العصبية البشرية (NeuN +) في مجموعة متنوعة من عينات الدماغ والمناطق التشريحية1،2،3،4.
ومع ذلك، كانت الطرق المماثلة لعزل مجموعات فرعية محددة من النوى الدبقية من القشرة البشرية محدودة، مما أدى إلى نقص نسبي في التطور في فهم تعقيد الخلايا النجمية في كل من الأنسجة الطبيعية والمريضة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تكييف بروتوكول نشر سابقا لعزل مجموعات الخلايا العصبية البشرية باستخدام FANS4 ، وتم التحقق من صحة طريقة لإثراء الخلايا النجمية (وللأسلاف oligodendroglial) باستخدام مزيج من الأجسام المضادة الثلاثية ، والتقاط الخلايا النجمية في كل من ظروف الراحة والتفاعل5. لإثراء الخلايا النجمية على وجه التحديد في الكسر NeuN- ، تم استخدام الأجسام المضادة ضد أحد عاملي النسخ المعروفين بالتعبير عنهما بشكل تفاضلي عبر مجموعات الخلايا النجمية ، PAX6 أو عامل النسخ SRY-box 9 (SOX9) 6,7. يتم التعبير عن PAX6 بشكل كبير خلال نمو الجنين المبكر داخل السلف الشبيه بالدبقية الشعاعية في المناطق الجرثومية ويساهم في كل من تكوين الخلايا العصبية وتكوين الخلايا الدبقية8،9،10،11 وكذلك في مواصفات الخلايا العصبية الشبكية12. في البالغين ، يتم التعبير عن PAX6 بشكل تفاضلي في الخلايا النجمية البشريةالمستريحة 6 ويظهر تعبيرا مشتركا للبروتين مع البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) في الخلايا النجمية لأنسجة الصرع البشري13.
يصف هذا البروتوكول العزلة المتزامنة للخلايا العصبية المخية الجديدة ومجموعات النوى الغنية بالخلايا النجمية بواسطة FANS. يتم أولا فصل أنسجة ما بعد الوفاة الطازجة (غير الثابتة) المجمدة (أي المجمدة الطازجة) التي تم جمعها من القشرة الدماغية البالغة ميكانيكيا وكيميائيا. بعد التحلل والطرد المركزي الفائق في تدرج السكروز ، يتم التخلص من المكونات السيتوبلازمية وخارج الخلية أثناء الاحتفاظ بالنواة. ثم يتم تصنيف النوى بأجسام مضادة نووية مترافقة بشكل فلوري تتوافق مع السلالات المستهدفة المطلوبة ويتم فرزها باستخدام المراوح. باتباع هذا النهج ، يتم إثبات إثراء الخلايا النجمية في مجموعات PAX6 + NeuN التي تم جمعها ، والتي تم التحقق من صحتها من خلال لوحة qPCR المستهدفة وكذلك من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي النووي في المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وينبغي وضع اللمسات الأخيرة على التصميم التجريبي وفقا للبروتوكول المحدد بعد النظر في عدة عوامل بيولوجية وتقنية. يتم تجميد عينات الأنسجة الأولية طازجة ، دون أن يتم إصلاحها ، ويفضل أن يكون لها فاصل زمني قصير لجمع ما بعد الوفاة لتحقيق أقصى قدر من استعادة النوى. استنادا إلى الخبرة ، يسمح مؤشر م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الأعضاء في علم الأمراض وجراحة الأعصاب في كلية إيكان للطب في ماونت سيناي للمساعدة في شراء أنسجة المخ غير المحددة و ISMMS Flow Cytometry CORE للحصول على مشورة الخبراء. تم تمويل الدراسة جزئيا من قبل NIH RF1DA048810 و R01NS106229 و R03NS101581 (إلى N.M.T.) و R61DA048207 (إلى S.A).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
