Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu
Summary
İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.
Abstract
İnsan astrositlerinin karmaşıklığı, birincil insan dokusunda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve izolasyonları ve moleküler karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Floresan ile aktive edilen çekirdek sıralama (FANS), insan nöronal çekirdek (NeuN +) popülasyonlarını donmuş arşiv dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek ve incelemek için kullanılabilir, böylece taze dokuyla ilgili sorunlardan kaçınılır. Bununla birlikte, astroglia’yı nöronal olmayan (NeuN-) elementten benzer şekilde izole etme çabaları eksiktir. Yakın zamanda geliştirilen ve doğrulanmış bir immünoetiketleme stratejisi, zenginleştirilmiş nöronal (NeuN +), astrosit (eşleştirilmiş kutu protein 6 (PAX6) + NeuN-) ve oligodendrosit progenitör (OLIG2 + NeuN-) çekirdek popülasyonlarını hastalıksız, taze (sabitlenmemiş) dondurulmuş postmortem insan temporal neokorteks dokusundan eşzamanlı olarak izole etmek için üç transkripsiyon faktörü antikoru kullanır.
Bu tekniğin primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişikliklerinin karakterizasyonunda yararlı olduğu gösterilmiştir. Transkriptomik analizler, PAX6 + NeuN sıralanmış popülasyonların pan-astrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve hem dinlenme hem de reaktif koşullarda astrositleri yakaladığını doğruladı. Bu makalede, astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının taze dondurulmuş insan korteksinden, doku ayrışmasının tek çekirdekli (sn) süspansiyona ayrıştırılması da dahil olmak üzere izolasyonu için FANS metodolojisi açıklanmaktadır; çekirdeklerin anti-NeuN ve anti-PAX6 floresan konjuge antikorlarla immünoetiketlenmesi; FANLAR, sıralama sırasında hassasiyeti ve özgüllüğü optimize etmek ve astrosit zenginleştirmesini onaylamak için geçit stratejileri ve kalite kontrol metrikleri; ve toplu veya sn çözünürlükte aşağı akış transkriptom ve kromatin erişilebilirlik sıralaması için önerilen tedarik. Bu protokol, çeşitli patolojileri olan nekrotik olmayan, taze dondurulmuş, insan kortikal örnekleri ve 24 saat içinde önerilen postmortem doku toplanması için geçerlidir.
Introduction
İnsan astrositlerinin moleküler karmaşıklığı, birincil dokuda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve hem sağlıkta hem de hastalıkta yüksek çözünürlükte izolasyonları ve karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Bozulmamış insan nöronlarının ve glia’nın nişlerinden ayrılmasının, taze beyin dokusu örneklerinin sınırlı erişimi, glial ve nöronal süreçlerin yoğun bir şekilde birbirine bağlı doğası ve işleme sırasında kaçınılmaz hücresel aktivasyon nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır; bunların hepsi bu hücre tiplerinin moleküler karakterizasyonunu ex vivo1 . Floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS), canlı hücre sıralamaya alternatif olarak ortaya çıkmış ve çekirdek popülasyonlarının donmuş dokudan ayrışmasını ve immün etiketlemesini sağlamıştır. Son on yılda, FANS, çeşitli beyin örneklerinde ve anatomik bölgelerdeinsan nöronal (NeuN +) çekirdek popülasyonlarını izole etmek ve moleküler olarak karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4.
Bununla birlikte, spesifik glial çekirdek alt popülasyonlarını insan korteksinden izole etmek için benzer yöntemler sınırlandırılmış ve hem normal hem de hastalıklı dokularda astrosit karmaşıklığının anlaşılmasında göreceli bir karmaşıklık eksikliğine yol açmıştır. Bu amaçla, FANS4 kullanarak insan nöronal popülasyonlarını izole etmek için daha önce yayınlanmış bir protokol uyarlandı ve üçlü bir antikor kombinasyonu kullanarak astrositler (ve oligodendroglial progenitörler) için zenginleştirmek için bir yöntem doğrulandı ve astrositleri hem dinlenme hem de reaktif koşullarda yakaladı5. NeuN fraksiyonundaki astrositler için spesifik olarak zenginleştirmek için, antikorlar astrosit popülasyonları arasında farklı olarak eksprese edildiği bilinen iki transkripsiyon faktöründen birine karşı kullanıldı, PAX6 veya SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9)6,7. PAX6, germinal bölgelerdeki radyal glia benzeri progenitörlerde erken fetal gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir ve hem nörogenez hem de gliogenez 8,9,10,11’e ve retinal nöronal spesifikasyona katkıda bulunur 12. Yetişkinlerde, PAX6, istirahat eden insan astrositlerinde6 farklı şekilde aşırı eksprese edilir ve insan epilepsi dokusu astrositlerinde glial fibriler asidik protein (GFAP) ile protein birlikte ekspresyonu gösterir13.
Bu protokol, neokortikal nöronal ve astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının FANS tarafından eşzamanlı izolasyonunu tanımlar. Yetişkin korteksten toplanan taze (sabitlenmemiş) çıtçıtlı dondurulmuş (yani, taze-dondurulmuş) postmortem doku ilk önce mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Bir sakkaroz gradyanında lizis ve ultrasantrifüjlemeden sonra, çekirdekler korunurken sitoplazmik ve hücre dışı bileşenler atılır. Çekirdekler daha sonra istenen hedef soylara karşılık gelen floresan konjuge nükleer antikorlarla etiketlenir ve FANS kullanılarak sıralanır. Bu yaklaşımı takiben, astrositlerin zenginleştirilmesi, toplanan PAX6 + NeuN- popülasyonlarında, hem hedeflenen bir qPCR paneli hem de aşağı akış nükleer RNA dizilimi ile doğrulanarak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Özetlenen protokolü takip eden deneysel tasarım, çeşitli biyolojik ve teknik faktörler göz önünde bulundurularak sonuçlandırılmalıdır. Başlangıç doku örnekleri, sabitlenmeden taze dondurulur ve tercihen çekirdek iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için kısa bir postmortem toplama aralığına sahiptir. Deneyime dayanarak, 24 saate kadar bir PMI, yeterli çekirdek geri kazanımına izin verir; Bununla birlikte, bozulmamış çekirdek geri kazanımını optimize etmek için 12 saat veya daha düş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sina Dağı’ndaki Icahn Tıp Fakültesi’ndeki Patoloji ve Nöroşirürji üyelerine, tanımlanmamış beyin dokusunun ve uzman tavsiyesi için ISMMS’nin Akış Sitometrisi CORE’unun tedarikinde yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Çalışma kısmen NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.’ye) ve R61DA048207 (SA’ya) tarafından finanse edildi.
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
