בידוד של אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות בוגרות מקורטקס קפוא טרי באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה
Summary
פיתחנו שיטה המעשירה ומבודדת אוכלוסיות אסטרוציטים אנושיות מרקמה קפואה טרייה לשימוש בניתוחים מולקולריים במורד הזרם.
Abstract
המורכבות של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמה האנושית הראשונית, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון המולקולרי שלהם. ניתן להשתמש במיון גרעינים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FANS) כדי לבודד ולחקור בהצלחה אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) מרקמה ארכיונית קפואה, ובכך להימנע מבעיות הקשורות לטיפול ברקמות טריות. עם זאת, חסרים מאמצים לבודד באופן דומה את האסטרוגליה מהאלמנט הלא-עצבי (NeuN-). אסטרטגיית תיוג אימונולוג שפותחה ואומתה לאחרונה משתמשת בשלושה נוגדנים של גורמי שעתוק כדי לבודד בו זמנית אוכלוסיות של גרעינים מועשרים עצביים מועשרים (NeuN+), אסטרוציטים (חלבון קופסה מזווג 6 (PAX6)+NeuN-), וגרעיניטור אוליגודנדרוציטים (OLIG2+NeuN-) מאוכלוסיות גרעינים מועשרים (OLIG2+NeuN-) מרקמת ניאו-קורטקס טמפורלית אנושית לא חולה, טרייה (לא מנוקבת).
טכניקה זו הוכחה כיעילה לאפיון שינויים בתעתיק ספציפי לסוג התא בניאוקורטקס אפילפסיה פתולוגית ראשונית. ניתוחי תעתיק אישרו כי אוכלוסיות ממוינות PAX6+NeuN מועשרות היטב עבור סמני פאן-אסטרוציטים ולוכדות אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית FANS לבידוד של אוכלוסיות גרעינים מועשרים באסטרוציטים מקליפת המוח האנושית הקפואה טרייה, כולל דיסוציאציה של רקמות לתרחיף של גרעין יחיד (sn); אימונו-תיוג של גרעינים עם נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים נגד NeuN ו-anti-PAX6; אוהדים מנצלים אסטרטגיות ומדדי בקרת איכות לאופטימיזציה של רגישות וספציפיות במהלך המיון ולאישור העשרת אסטרוציטים; ורכש מומלץ לריצוף תעתיק במורד הזרם ונגישות כרומטין ברזולוציית תפזורת או sn. פרוטוקול זה ישים עבור דגימות קליפת המוח האנושיות שאינן נמקיות, קפואות טריות, עם פתולוגיות שונות ואיסוף רקמות מומלץ לאחר המוות תוך 24 שעות.
Introduction
המורכבות המולקולרית של האסטרוציטים האנושיים נותרה לא מוגדרת היטב ברקמות הראשוניות, ודורשת כלים טובים יותר לבידוד ולאפיון שלהם ברזולוציה גבוהה, הן בבריאות והן במחלות. הפרדת תאי עצב אנושיים וגליה שלמים מהנישה שלהם הוכחה כקשה בשל גישה מוגבלת של דגימות רקמת מוח טריות, האופי המקושר בכבדות של תהליכי גליה ונוירונים, והפעלה תאית בלתי נמנעת במהלך העיבוד, כל אלה מגבילים את האפיון המולקולרי של סוגי תאים אלה ex vivo1 . מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FANS) התגלה כחלופה למיון תאים חיים, המאפשר דיסוציאציה ואימונו-תיוג של אוכלוסיות גרעינים מרקמה קפואה. בעשור האחרון, FANS הפך לשימוש נרחב לבידוד ואפיון מולקולרי של אוכלוסיות גרעינים עצביים אנושיים (NeuN+) במגוון דגימות מוח ואזורים אנטומיים 1,2,3,4.
עם זאת, שיטות דומות לבידוד תת-אוכלוסיות של גרעיני גליה ספציפיים מקליפת המוח האנושית היו מוגבלות, מה שהוביל לחוסר תחכום יחסי בהבנת מורכבות האסטרוציטים ברקמות נורמליות וחולות כאחד. לשם כך, פרוטוקול שפורסם בעבר הותאם לבידוד אוכלוסיות נוירונים אנושיות באמצעות FANS4, ואומתה שיטה להעשרתם עבור אסטרוציטים (ועבור אבות אוליגודנדרוגליאליים) באמצעות שילוב נוגדנים משולש, לכידת אסטרוציטים הן בתנאי מנוחה והן בתנאים תגובתיים5. כדי להעשיר באופן ספציפי עבור אסטרוציטים בשבר ה-NeuN, נעשה שימוש בנוגדנים כנגד אחד משני גורמי שעתוק הידועים כמבוטאים באופן דיפרנציאלי בין אוכלוסיות אסטרוציטים, PAX6 או גורם שעתוק תיבת SRY 9 (SOX9)6,7. PAX6 מתבטאת מאוד במהלך ההתפתחות המוקדמת של העובר בתוך אבות דמויי גליה רדיאליים באזורי חיידקים ותורמת הן לנוירוגנזה והן לגליוגנזה 8,9,10,11, כמו גם למפרט העצבי ברשתית 12. במבוגר, PAX6 מתבטא יתר על המידה במנוחה של אסטרוציטים אנושיים6 ומראה ביטוי משותף של חלבון עם חלבון חומצי פרפור גלי (GFAP) באסטרוציטים של רקמת אפילפסיה אנושית13.
פרוטוקול זה מתאר בידוד סימולטני של אוכלוסיות גרעינים ניאו-קורטיקליים עצביים ואסטרוציטים מועשרים על ידי FANS. רקמה טרייה (לא קפואה) (כלומר, קפואה-טרייה) לאחר המוות שנאספה מקליפת המוח הבוגרת מנותקת תחילה מכנית וכימית. לאחר תזה ואולטרה-צנטריפוגציה בשיפוע סוכרוז, הרכיבים הציטופלסמיים והחוץ-תאיים מושלכים בעוד הגרעינים נשמרים. לאחר מכן גרעינים מסומנים בנוגדנים גרעיניים מצומדים פלואורסצנטית המתאימים לשושלות המטרה הרצויות וממוינים באמצעות FANS. בעקבות גישה זו, העשרת האסטרוציטים מודגמת באוכלוסיות PAX6+NeuN שנאספו, ומאומתת הן על ידי לוח qPCR ממוקד והן על ידי ריצוף RNA גרעיני במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לסיים את התכנון הניסויי על פי הפרוטוקול המתואר לאחר ששקל מספר גורמים ביולוגיים וטכניים. דגימות הרקמות המתחילות מוקפאות טריות, מבלי שתוקנו, ועדיף שיהיה להן מרווח איסוף קצר לאחר המוות כדי למקסם את התאוששות הגרעינים. בהתבסס על ניסיון, PMI של עד 24 שעות מאפשר התאוששות גרעינים נאותה; עם זאת, PMI ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לחברים בפתולוגיה ונוירוכירורגיה בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני על העזרה ברכישת רקמת מוח שלא זוהתה ול-Flow Cytometry CORE של ISMMS על ייעוץ מומחה. המחקר מומן בחלקו על ידי NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (ל- N.M.T.) ו- R61DA048207 (ל- S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
