Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence
Summary
Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.
Abstract
La complexité des astrocytes humains reste mal définie dans les tissus humains primaires, nécessitant de meilleurs outils pour leur isolement et leur caractérisation moléculaire. Le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) peut être utilisé pour isoler et étudier avec succès des populations de noyaux neuronaux humains (NeuN+) à partir de tissus d’archives congelés, évitant ainsi les problèmes associés à la manipulation de tissus frais. Cependant, les efforts pour isoler de la même manière l’astroglie de l’élément non neuronal (NeuN-) font défaut. Une stratégie d’immunomarquage récemment développée et validée utilise trois anticorps de facteur de transcription pour isoler simultanément des populations de noyaux neuronaux enrichis (NeuN+), astrocytes (protéine de boîte appariée 6 (PAX6)+NeuN-) et oligodendrocytes progéniteurs (OLIG2+NeuN-) à partir de tissus de néocortex humains post-mortem non malades, frais (non fixés) congelés par bouton-pression.
Cette technique s’est avérée utile pour la caractérisation des altérations du transcriptome spécifiques au type cellulaire dans le néocortex de l’épilepsie pathologique primaire. Les analyses transcriptomiques ont confirmé que les populations triées PAX6+ NeuN sont solidement enrichies pour les marqueurs pan-astrocytaires et capturent les astrocytes dans des conditions de repos et de réactivité. Cet article décrit la méthodologie FANS pour l’isolement des populations de noyaux enrichis en astrocytes du cortex humain fraîchement congelé, y compris la dissociation tissulaire en suspension à noyau unique (sn); immunomarquage des noyaux avec des anticorps conjugués par fluorescence anti-NeuN et anti-PAX6; Stratégies de contrôle DE LA FAN et mesures de contrôle de la qualité pour optimiser la sensibilité et la spécificité lors du tri et pour confirmer l’enrichissement des astrocytes; et l’approvisionnement recommandé pour le séquençage de l’accessibilité du transcriptome et de la chromatine en aval à une résolution en vrac ou en sn. Ce protocole est applicable aux échantillons corticaux humains non nécrotiques, fraîchement congelés, présentant diverses pathologies et au prélèvement de tissus post-mortem recommandé dans les 24 heures.
Introduction
La complexité moléculaire des astrocytes humains reste mal définie dans les tissus primaires, nécessitant de meilleurs outils pour leur isolement et leur caractérisation à haute résolution, à la fois dans la santé et la maladie. La séparation des neurones humains intacts et de la glie de leur niche s’est avérée difficile en raison de l’accès limité à des échantillons de tissus cérébraux frais, de la nature fortement interconnectée des processus gliaux et neuronaux et de l’activation cellulaire inévitable pendant le traitement, qui limitent la caractérisation moléculaire de ces types de cellules ex vivo1 . Le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) est apparu comme une alternative au tri des cellules vivantes, permettant la dissociation et l’immunotagging des populations de noyaux à partir de tissus congelés. Au cours de la dernière décennie, FANS est devenu largement utilisé pour isoler et caractériser moléculairement les populations de noyaux neuronaux humains (NeuN+) dans une variété de spécimens de cerveau et de régions anatomiques 1,2,3,4.
Cependant, des méthodes similaires pour isoler des sous-populations spécifiques de noyaux gliaux du cortex humain ont été limitées, ce qui a conduit à un manque relatif de sophistication dans la compréhension de la complexité des astrocytes dans les tissus normaux et malades. À cette fin, un protocole précédemment publié a été adapté pour isoler les populations neuronales humaines à l’aide de FANS4, et une méthode a été validée pour enrichir les astrocytes (et les progéniteurs oligodendrogliaux) en utilisant une combinaison de triples anticorps, capturant les astrocytes dans des conditions reposantes et réactives5. Pour enrichir spécifiquement les astrocytes de la fraction NeuN-, des anticorps ont été utilisés contre l’un des deux facteurs de transcription connus pour être exprimés différemment dans les populations d’astrocytes, PAX6 ou SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 est fortement exprimé au cours du développement fœtal précoce dans les progéniteurs de type glie radiale dans les zones germinales et contribue à la fois à la neurogenèse et à la gliogenèse 8,9,10,11 ainsi qu’à la spécification neuronale rétinienne 12. Chez l’adulte, PAX6 est surexprimé différentiellement dans les astrocytes humainsau repos 6 et montre une co-expression protéique avec la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) dans les astrocytes tissulaires de l’épilepsie humaine13.
Ce protocole décrit l’isolement simultané des populations de noyaux néocorticaux neuronaux et enrichis en astrocytes par FANS. Le tissu post-mortem frais (non fixé) congelé (c.-à-d. fraîchement congelé) prélevé dans le cortex adulte est d’abord dissocié mécaniquement et chimiquement. Après lyse et ultracentrifugation dans un gradient de saccharose, les composants cytoplasmiques et extracellulaires sont éliminés tandis que les noyaux sont conservés. Les noyaux sont ensuite marqués avec des anticorps nucléaires conjugués par fluorescence correspondant aux lignées cibles souhaitées et triés à l’aide de FANS. Suite à cette approche, l’enrichissement des astrocytes est démontré dans les populations PAX6+NeuN- collectées, validées à la fois par un panel qPCR ciblé ainsi que par le séquençage de l’ARN nucléaire en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
La conception expérimentale suivant le protocole décrit devrait être finalisée après avoir pris en compte plusieurs facteurs biologiques et techniques. Les échantillons de tissus de départ sont fraîchement congelés, sans avoir été fixés, et ont de préférence un court intervalle de prélèvement post-mortem pour maximiser la récupération des noyaux. Sur la base de l’expérience, un PMI allant jusqu’à 24 h permet une récupération adéquate des noyaux; cependant, un PMI de 12 h ou moins est préférab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres en pathologie et neurochirurgie de l’École de médecine Icahn du mont Sinaï pour leur aide dans l’approvisionnement en tissus cérébraux anonymisés et le CORE de cytométrie en flux de l’ISMMS pour les conseils d’experts. L’étude a été partiellement financée par NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (à N.M.T.) et R61DA048207 (à S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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