Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering
Summary
We hebben een methode ontwikkeld die menselijke astrocytenpopulaties verrijkt en isoleert van vers ingevroren weefsel voor gebruik in downstream moleculaire analyses.
Abstract
De complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair menselijk weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en moleculaire karakterisering. Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) kan worden gebruikt om menselijke neuronale kernen (NeuN +) populaties met succes te isoleren en te bestuderen uit bevroren archiefweefsel, waardoor problemen in verband met het omgaan met vers weefsel worden vermeden. Pogingen om astroglia op dezelfde manier te isoleren van het niet-neuronale (NeuN-) element ontbreken echter. Een recent ontwikkelde en gevalideerde immunotaggingstrategie maakt gebruik van drie transcriptiefactorantistoffen om tegelijkertijd verrijkte neuronale (NeuN+), astrocyten (gepaard boxeiwit 6 (PAX6)+NeuN-) en oligodendrocytenvoorloper (OLIG2+NeuN-) kernpopulaties te isoleren uit niet-zieke, verse (niet-gefixeerde) snap-bevroren postmortaal humaan humaan humaan neocortexweefsel.
Deze techniek bleek nuttig te zijn voor de karakterisering van celtypespecifieke transcriptoomveranderingen in primaire pathologische epilepsie neocortex. Transcriptomische analyses bevestigden dat PAX6+NeuN-gesorteerde populaties robuust verrijkt zijn voor pan-astrocytenmarkers en astrocyten vangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden. Dit artikel beschrijft de FANS-methodologie voor de isolatie van met astrocyten verrijkte kernpopulaties uit vers ingevroren menselijke cortex, inclusief weefseldissociatie in single-nucleus (sn) suspensie; immunotagging van kernen met anti-NeuN en anti-PAX6 fluorescerend geconjugeerde antilichamen; FANS gating strategieën en kwaliteitscontrole statistieken voor het optimaliseren van gevoeligheid en specificiteit tijdens het sorteren en voor het bevestigen van astrocytenverrijking; en aanbevolen inkoop voor downstream transcriptoom- en chromatine-toegankelijkheidssequencing bij bulk- of sn-resolutie. Dit protocol is van toepassing op niet-necrotische, vers ingevroren, menselijke corticale monsters met verschillende pathologieën en aanbevolen postmortale weefselverzameling binnen 24 uur.
Introduction
De moleculaire complexiteit van menselijke astrocyten blijft slecht gedefinieerd in primair weefsel, waardoor betere hulpmiddelen nodig zijn voor hun isolatie en karakterisering met hoge resolutie, zowel in gezondheid als ziekte. Scheiding van intacte menselijke neuronen en glia uit hun niche is moeilijk gebleken vanwege de beperkte toegang tot verse hersenweefselmonsters, de sterk onderling verbonden aard van gliale en neuronale processen en onvermijdelijke cellulaire activering tijdens de verwerking, die allemaal de moleculaire karakterisering van deze celtypen ex vivo beperken 1 . Fluorescentie-geactiveerde kernensortering (FANS) is naar voren gekomen als een alternatief voor het sorteren van levende cellen, waardoor de dissociatie en immunotagging van kernpopulaties uit bevroren weefsel mogelijk wordt. In het afgelopen decennium is FANS op grote schaal gebruikt voor het isoleren en moleculair karakteriseren van menselijke neuronale (NeuN +) kernpopulaties in een verscheidenheid aan hersenspecimens en anatomische regio’s 1,2,3,4.
Vergelijkbare methoden voor het isoleren van specifieke gliakernen subpopulaties uit de menselijke cortex zijn echter beperkt, wat leidt tot een relatief gebrek aan verfijning in het begrip van astrocytencomplexiteit in zowel normale als zieke weefsels. Hiertoe werd een eerder gepubliceerd protocol aangepast voor het isoleren van menselijke neuronale populaties met behulp van FANS4, en een methode werd gevalideerd om te verrijken voor astrocyten (en voor oligodendrogliale voorlopers) met behulp van een drievoudige antilichaamcombinatie, waarbij astrocyten werden gevangen in zowel rust- als reactieve omstandigheden5. Om specifiek te verrijken voor astrocyten in de NeuN-fractie, werden antilichamen gebruikt tegen een van de twee transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze differentieel tot expressie komen tussen astrocytenpopulaties, PAX6 of SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 komt sterk tot expressie tijdens de vroege foetale ontwikkeling binnen radiale glia-achtige voorlopercellen in germinale zones en draagt bij aan zowel neurogenese als gliogenese 8,9,10,11 en aan retinale neuronale specificatie 12. Bij de volwassene is PAX6 differentieel overexpressie in rustende menselijke astrocyten6 en vertoont eiwitco-expressie met gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP) in menselijke epilepsieweefselastryoten13.
Dit protocol beschrijft de gelijktijdige isolatie van neocorticale neuronale en astrocyten-verrijkte kernpopulaties door FANS. Vers (niet-gefixeerd) snap-bevroren (d.w.z. vers ingevroren) postmortaal weefsel verzameld uit de volwassen cortex wordt eerst mechanisch en chemisch gedissocieerd. Na lysis en ultracentrifugatie in een sucrosegradiënt worden de cytoplasmatische en extracellulaire componenten weggegooid terwijl de kernen worden behouden. Kernen worden vervolgens gelabeld met fluorescerend geconjugeerde nucleaire antilichamen die overeenkomen met de gewenste doellijnen en gesorteerd met behulp van VENTILATOREN. Volgens deze benadering wordt verrijking van astrocyten aangetoond in de verzamelde PAX6+NeuN-populaties, gevalideerd door zowel een gericht qPCR-paneel als door downstream nucleaire RNA-sequencing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimenteel ontwerp volgens het geschetste protocol moet worden afgerond na overweging van verschillende biologische en technische factoren. Beginnende weefselmonsters zijn vers ingevroren, zonder te zijn gefixeerd, en hebben bij voorkeur een kort postmortaal verzamelinterval om het herstel van kernen te maximaliseren. Op basis van ervaring zorgt een PMI van maximaal 24 uur voor adequaat kernherstel; een PMI van 12 uur of minder heeft echter de voorkeur om het herstel van intacte kernen te optimaliseren. Bijkomende fac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag leden in pathologie en neurochirurgie aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï bedanken voor hulp bij de aanschaf van niet-geïdentificeerd hersenweefsel en ISMMS’s Flow Cytometry CORE voor deskundig advies. De studie werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (naar N.M.T.) en R61DA048207 (naar S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
