Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência
Summary
Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.
Abstract
A complexidade dos astrócitos humanos permanece mal definida no tecido humano primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização molecular. A triagem de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) pode ser usada para isolar e estudar com sucesso as populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) a partir de tecido arquivado congelado, evitando problemas associados ao manuseio de tecido fresco. No entanto, faltam esforços para isolar a astroglia da elemento não neuronal (NeuN-) Uma estratégia de imunotagging recentemente desenvolvida e validada usa três anticorpos fator de transcrição para isolar simultaneamente populações neuronais enriquecidas (NeuN+), astrócito (proteína de caixa emparelhada 6 (PAX6)+NeuN-), e progenitor de progenitor de oligodendrocite (OLIG2+NeuN-) populações de neocórtex temporal não-doente, fresco (não fixado)
Esta técnica mostrou-se útil para a caracterização de alterações transcriptome específicas do tipo celular no neocórtex da epilepsia patológica primária. Análises transcriômicas confirmaram que as populações classificadas por PAX6+NeuN são robustamente enriquecidas para marcadores pan-astrócitos e capturam astrócitos em condições de repouso e reativas. Este artigo descreve a metodologia FANS para o isolamento de populações de núcleos enriquecidos por astrócitos a partir de córtex humano congelado fresco, incluindo dissociação de tecido em suspensão de núcleo único (sn); imunotagging de núcleos com anticorpos anti-NeuN e anti-PAX6 fluorescentemente conjugados; Estratégias de gating do FANS e métricas de controle de qualidade para otimizar sensibilidade e especificidade durante a triagem e para confirmar o enriquecimento de astrócitos; e aquisição recomendada para sequenciamento de acessibilidade de transcriptome a jusante e cromatina em resolução a granel ou sn. Este protocolo é aplicável para amostras corticais não necróticas, congeladas e humanas com várias patologias e coleta recomendada de tecido pós-morte dentro de 24 h.
Introduction
A complexidade molecular dos astrócitos humanos permanece pouco definida no tecido primário, exigindo melhores ferramentas para seu isolamento e caracterização em alta resolução, tanto na saúde quanto na doença. A separação de neurônios humanos intactos e glia de seu nicho tem se mostrado difícil devido ao acesso limitado de amostras de tecido cerebral fresco, à natureza fortemente interconectada dos processos gliais e neuronais, e à inevitável ativação celular durante o processamento, tudo isso limitando a caracterização molecular desses tipos celulares ex vivo1 . A classificação de núcleos ativados pela fluorescência (FANS) surgiu como uma alternativa à classificação de células vivas, permitindo a dissociação e o imunotagging das populações de núcleos a partir de tecido congelado. Na última década, o FANS tornou-se amplamente utilizado para isolar e caracterizar molecularmente populações de núcleos neuronais humanos (NeuN+) em uma variedade de espécimes cerebrais e regiões anatômicas 1,2,3,4.
No entanto, métodos semelhantes para isolar subpopulações específicas de núcleos gliais do córtex humano têm sido limitados, levando a uma relativa falta de sofisticação na compreensão da complexidade dos astrócitos em tecidos normais e doentes. Para isso, um protocolo publicado anteriormente foi adaptado para isolar populações neuronais humanas usando o FANS4, e um método foi validado para enriquecer para os astrócitos (e para progenitores oligodendroglial) usando uma combinação de anticorpos triplos, capturando astrócitos em condições de repouso e reativa5. Para enriquecer especificamente os astrócitos na fração de NeuN, anticorpos foram usados contra um dos dois fatores de transcrição conhecidos por serem expressos diferencialmente entre populações de astrócitos, pax6 ou fator de transcrição caixa de SRY 9 (SOX9)6,7. Pax6 é altamente expresso durante o desenvolvimento fetal precoce dentro de progenitores radiais semelhantes a glia em zonas germinais e contribui para neurogênese e gliogênese 8,9,10,11, bem como para especificação neuronal12. No adulto, pax6 é diferencialmente superexpresso em astrócitos humanosem repouso 6 e mostra co-expressão proteica com proteína ácida fibrilar gliana (GFAP) em astrócitos de tecido de epilepsia humana13.
Este protocolo descreve o isolamento simultâneo das populações de núcleos neocorticais e enriquecidos por astrócitos pelo FANS. O tecido pós-morte fresco (não fixado) (ou seja, congelado fresco) coletado do córtex adulto é primeiro dissociado mecanicamente e quimicamente. Após a lise e a ultracentrifugação em um gradiente de sacarose, os componentes citoplasmados e extracelulares são descartados enquanto os núcleos são retidos. Os núcleos são então rotulados com anticorpos nucleares fluorescentes conjugados correspondentes às linhagens alvo desejadas e classificados usando VENTILADORES. Após essa abordagem, o enriquecimento dos astrócitos é demonstrado nas populações PAX6+NeuN coletadas, validadas tanto por um painel qPCR direcionado quanto pelo sequenciamento nuclear de RNA a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O desenho experimental seguindo o protocolo delineado deve ser finalizado após considerar vários fatores biológicos e técnicos. As amostras de tecido inicial são congeladas frescas, sem terem sido fixadas, e de preferência têm um curto intervalo de coleta pós-morte para maximizar a recuperação dos núcleos. Com base na experiência, um PMI de até 24 horas permite a recuperação adequada dos núcleos; no entanto, um PMI de 12 h ou menos é preferível para otimizar a recuperação de núcleos intactos. Fatores…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostamos de agradecer aos membros da Patologia e Neurocirurgia da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai pela ajuda na aquisição de tecido cerebral desidentifitado e no CORE de Citometria de Fluxo do ISMMS para aconselhamento especializado. O estudo foi parcialmente financiado pelo NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (para N.M.T.) e R61DA048207 (para S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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