Protocole de préparation et de transfert d’échantillons pour la cristallographie à longue longueur d’onde sous vide sur la ligne de faisceau I23 à la source lumineuse Diamond

La diffraction des rayons X à longue longueur d’onde est utilisée pour exploiter les propriétés de diffusion anormales d’atomes de lumière spécifiques présents nativement dans les macromolécules. Cela aide à résoudre le problème de la phase cristallographique et à confirmer sans ambiguïté l’identité et l’emplacement de ces éléments dans les macromolécules. Alors qu’aux débuts de la cristallographie macromoléculaire, les structures de novo étaient résolues par de multiples remplacements isomorphes1, avec l’avènement des lignes de faisceau de rayons X accordables aux synchrotrons, le phasage expérimental basé sur des techniques de diffraction anormale multi-longueurs d’onde et à longueur d’onde unique (SAD) est devenu la méthode ^dominante2 . Les deux méthodes se sont historiquement appuyées sur le signal isomorphe ou anormal des métaux lourds, qui doivent être introduits artificiellement dans les cristaux par cocristallisation ou trempage des ^cristaux3. L’approche par essais et erreurs et les résultats imprévisibles peuvent rendre ces expériences frustrantes et chronophages. L’incorporation de séléno-méthionine lors de l’expression des ^protéines4 est un moyen très élégant de surmonter ces limitations et d’exploiter la diffraction anormale à de courtes longueurs d’onde, bien qu’elle puisse être très difficile dans les systèmes d’expression des protéines eucaryotes.

La MX à longue longueur d’onde est extrêmement attrayante pour la détermination de la structure par des expériences natives de ^TAS5,6 en raison de la commodité d’utiliser des cristaux directement issus d’un essai de cristallisation réussi sans traitement supplémentaire. De plus, l’accès aux bords d’absorption d’éléments de haute importance biologique, tels que le calcium, le potassium, le chlore, le soufre et le phosphore, ouvre la possibilité d’identifier directement les positions de ces éléments dans les macromolécules7,8,9,10. À moyenne et basse résolution, l’assignation d’éléments basée sur la densité d’électrons _2Fo-Fc et l’environnement chimique peut être difficile, en particulier pour les éléments ayant un nombre similaire d’électrons ou des ions faiblement liés avec des occupations partielles. Ces ambiguïtés peuvent être résolues en collectant des données au-dessous et au-dessus du bord d’absorption de l’élément d’intérêt et en interprétant la différence anormale par le modèle résultante des cartes de ^Fourier11,12. La localisation des positions des atomes de soufre dans ces cartes peut également faciliter la construction de modèles dans des cartes de densité d’électrons à basse ^{résolution13}. Les bords d’absorption de ces éléments lumineux sont observés à des longueurs d’onde comprises entre λ = 3 et 6 Å (voir Figure 1, en haut). Cette gamme de longueurs d’onde a été bien au-delà des capacités de toute ligne de faisceau SYNCHROTRON MX, et un fonctionnement efficace dans cette gamme nécessite de surmonter plusieurs défis techniques, comme indiqué ci-dessous.

La ligne de faisceau I23 de Diamond Light Source, au Royaume-Uni, est un instrument unique, spécialement conçu pour faciliter les expériences MX de longue longueur d’onde, accordable dans une gamme de longueurs d’onde comprise entre λ = 1,13 et 5,9 Å (plage d’énergie comprise entre E = 2,1 et 11 keV). En fonctionnant dans un environnement à vide ^poussé14, l’absorption et la diffusion de l’air sont éliminées, ce qui améliore l’efficacité des expériences de diffraction et le rapport signal/bruit. Une grande station d’extrémité de vide englobe tous les composants de l’environnement de l’échantillon, y compris le détecteur semi-cylindrique Pilatus 12M, un goniomètre multi-axes, les systèmes de visualisation et de collimation en ligne, ainsi que l’équipement sur mesure pour le transfert et le stockage des échantillons (Figure 2). Chaque équipement a été optimisé pour garantir la collecte de données de longue longueur d’onde de la meilleure qualité. Le détecteur pilatus 12M incurvé peut collecter des angles de diffraction de 2θ = ±100°, ce qui donne des données de diffraction suffisamment élevées, même aux longueurs d’onde les plus longues (Figure 1, en bas). Les 120 modules de détection ont été spécifiquement sélectionnés pour la compatibilité à faible consommation d’énergie et des étalonnages pour un mode de gain ultra-élevé supplémentaire ont été fournis.

Le seuil de détection le plus bas possible est de 1,8 keV, ce qui entraîne une augmentation des effets de coin et de bord pour les énergies inférieures à 3,6 keV et une qualité de données compromise aux longueurs d’onde les plus longues, en particulier pour les cristaux de faible mosaïquence, peut être observée. Cet effet, combiné à la diminution de l’efficacité quantique du ^{détecteur15,} doit être pris en considération lors de la planification d’une expérience. Le goniomètre multi-axes permet la réorientation des cristaux pour permettre des stratégies de collecte de données qui maximisent la qualité et la force du signal anormal, ainsi que l’exhaustivité des données anormales collectées. L’absorption de l’échantillon est un facteur limitant pour les expériences, en particulier aux longueurs d’onde les plus longues. Les corrections d’absorption, telles qu’elles sont mises en œuvre dans les progiciels de traitement MX couramment ^{utilisés16,17}, fonctionnent bien à des longueurs d’onde autour de 3 Å. Des longueurs d’onde plus longues nécessiteront des corrections analytiques d’absorption basées sur des reconstructions ^{tomographiques18} ou une ablation au laser pour éliminer les matériaux non diffractants et découper les cristaux en formes bien ^définies19. Ce dernier aidera également à réduire la taille des cristaux plus gros, car les expériences de diffraction des rayons X à des longueurs d’onde plus longues sont plus efficaces pour les cristaux plus ^petits14. Le défi de la conservation des échantillons à des températures cryogéniques pendant la collecte des données est relevé par le refroidissement conducteur, car l’utilisation de dispositifs à flux de gaz froid à flux ouvert n’est pas compatible avec un environnement sous vide. Par conséquent, des matériaux thermiquement conducteurs, tels que le cuivre, sont nécessaires pour connecter l’échantillon à un refroidisseur cryogénique à tube d’impulsion. Les broches standard SPINE en acier inoxydable utilisées dans MX, ainsi que tout autre support d’échantillon disponible dans le commerce, ne conviennent pas à la MX à longue longueur d’onde sous vide en raison de leur faible conductivité thermique.

Les porte-échantillons (SH) pour MX sous vide doivent être une partie essentielle de la voie thermique d’évacuation de la chaleur (Figure 3A). En tant que tels, ils se composent d’un corps et d’une broche en cuivre thermiquement conducteurs et comprennent deux caractéristiques importantes: une base magnétique forte pour assurer une liaison thermique adéquate avec la tête du goniomètre froid, et un support d’échantillon, en polyimide, pour minimiser l’absorption et la diffusion des rayons ^X20. Des efforts ont été déployés pour s’assurer que l’expérience utilisateur de la récolte des cristaux et du refroidissement par flash est presque identique à celle associée aux pratiques MX standard. Comme les I23 SH dédiés ne sont pas directement compatibles avec d’autres lignes de faisceau synchrotron, un adaptateur en acier inoxydable est utilisé pour la compatibilité avec les baguettes magnétiques à récupération de cristaux et les interfaces goniomètre existantes sur d’autres lignes de faisceau MX (Figure 3B). L’adaptateur est également important pour utiliser les installations d’automatisation sur d’autres lignes de faisceau Diamond MX, qui sont basées sur des têtes de préhension de robot de type ^ALS21 et des configurations de base de style ^unipuck22, si la variation de l’échantillon nécessite un pré-criblage rapide pour la sélection des meilleurs cristaux diffractants. Le protocole de préparation et de chargement de l’échantillon peut être divisé en deux étapes :

Étape 1 : Récolte des cristaux et congélation éclair effectuée par les utilisateurs dans leurs propres laboratoires

Après l’évaluation de l’adéquation du projet pour la collecte de données I23, des porte-échantillons avec des boucles correspondant à la taille des cristaux (pré-assemblés avec des adaptateurs) sont envoyés aux laboratoires utilisateurs pour la récolte des cristaux. Pour éviter tout dommage, les SH et les adaptateurs ne doivent pas être séparés et doivent être utilisés comme une seule unité dans le but de pêcher des cristaux avec des boucles de taille appropriée à l’aide de baguettes magnétiques standard de récolte de cristaux. Comme c’est souvent le cas en MX, cette tâche est effectuée manuellement au microscope et les cristaux sont immédiatement refroidis par flash dans un dewar en mousse avec de l’azote ^liquide23. En raison d’un décalage des forces magnétiques, les SH ne sont actuellement pas compatibles avec les unipucks. Le stockage et l’expédition sont réalisés à l’aide de combipucks (voir le tableau des matériaux), qui sont disponibles pour les utilisateurs sur demande, ainsi que les inserts d’expéditeur sec compatibles (Figure 3C). Ces rondelles partagent la même plaque de base avec les unipucks largement utilisés et permettent un pré-criblage rapide des échantillons sur d’autres lignes de faisceau Diamond MX. Le prêt de cet équipement aux utilisateurs est actuellement le meilleur arrangement, jusqu’à ce que les porte-échantillons sur mesure soient disponibles dans le commerce. Le transport vers la ligne de faisceau nécessite les expéditeurs secs standard utilisés dans la communauté MX.

Étape 2 : Transfert des échantillons cryo-refroidis dans la station d’extrémité sous vide

Une fois que les échantillons arrivent sur la ligne de faisceau, ils sont préparés pour être transférés dans la station d’extrémité du vide. Cela implique le retrait des SH des combipucks et la séparation des adaptateurs. L’introduction d’échantillons biologiques dans le vide est systématiquement effectuée dans le domaine de la cryo-microscopie électronique. Certains des concepts bien établis ont été adaptés pour le transfert d’échantillons I23. En bref, les SH sont transférés sous azote liquide sur des blocs de transfert (Figure 3D). Ces blocs ont une excellente conductivité thermique et une masse thermique importante, empêchant les cristaux d’atteindre la température de transition vitreuse dans le vide. Jusqu’à quatre blocs, d’une capacité de quatre échantillons chacun, sont chargés sous azote liquide dans une rondelle de bloc (figure 3H), qui est utilisée soit pour transférer des échantillons vers le système de transfert cryogénique (CTS), soit pour le stockage dans des dewars d’azote liquide entre les expériences.

Le système de transfert cryogénique développé à Diamond Light Source comprend deux sous-ensembles, la station d’échantillonnage et la navette (Figure 4A). La station d’échantillonnage se compose d’un bain d’azote liquide pour le stockage temporaire des cristaux de protéines et possède des caractéristiques spécifiques pour assurer la sécurité et permettre une expérience conviviale (Figure 5). Le CTS est contrôlé par un contrôleur logique programmable via une interface à écran tactile conviviale. La station d’échantillonnage est équipée de diodes électroluminescentes intégrées pour une meilleure visualisation et d’un ensemble de dispositifs de chauffage contrôlés en boucle rapprochée pour automatiser le séchage du bain d’azote liquide une fois les échantillons transférés. Il dispose également d’une variété de capteurs pour assurer la sécurité et le fonctionnement efficace du système. La station d’échantillonnage dispose d’un matériel sur mesure pour fournir une interface électrique fiable permettant d’interagir avec la navette pour les opérations, telles que le pompage jusqu’au vide brut pour le transfert d’échantillons, ainsi que la surveillance des niveaux d’azote liquide et de la température à l’intérieur de la navette.

La navette (figure 6) est un dispositif portable utilisé pour ramasser un bloc de transfert du bain d’azote liquide de la station d’échantillonnage et le transférer à l’intérieur d’un environnement cryogénique et sous vide jusqu’à la station finale. Il comprend un dewar à l’azote liquide pour garder les échantillons au froid pendant le transfert, une surveillance du niveau de liquide dans le dewar et une variété de capteurs pour le fonctionnement et la sécurité de l’utilisateur. Le bras de transfert est équipé d’un entraînement magnétique et comprend des rainures usinées pour guider les utilisateurs dans le chargement et le déchargement en toute sécurité des blocs de transfert dans la station d’extrémité. Le transfert de la navette à la cuve à vide s’effectue via un sas. Le sas est une interface pour la navette sur la station d’extrémité utilisée pour évacuer l’espace entre la navette et la station d’extrémité, avant d’ouvrir la navette et les soupapes de dépression de la station d’extrémité. Les séquences de pompage et de ventilation sont entièrement automatisées et peuvent être commandées via un grand écran tactile avec une interface conviviale (Figure 4C). Le protocole actuel est utilisé pour transférer un cristal de thaumatine à la station d’extrémité du vide pour la collecte de données.