Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Röntgendiffractie met lange golflengte wordt gebruikt om de abnormale verstrooiingseigenschappen van specifieke lichtatomen die inheems aanwezig zijn in macromoleculen te benutten. Dit helpt om het kristallografische faseprobleem op te lossen en om de identiteit en locatie van dergelijke elementen binnen macromoleculen ondubbelzinnig te bevestigen. Terwijl in de begindagen van de macromoleculaire kristallografie de novo structuren werden opgelost door multipele isomorf ^substitutie1, met de komst van afstembare röntgenbundellijnen bij synchrotrons, zijn experimentele fasering op basis van multi-golflengte en single-golflengte (SAD) afwijkende diffractietechnieken de dominante methoden ^geworden2 . Beide methoden hebben historisch vertrouwd op het isomorf of abnormale signaal van zware metalen, die kunstmatig in de kristallen moeten worden ingebracht door co-kristallisatie of ^{kristalweek3.} De trial-and-error-aanpak en onvoorspelbare uitkomst kunnen deze experimenten frustrerend tijdrovend maken. De opname van seleno-methionine tijdens ^{eiwitexpressie4} is een zeer elegante manier om deze beperkingen te overwinnen en abnormale diffractie op korte golflengten te benutten, hoewel het zeer uitdagend kan zijn in eukaryote eiwitexpressiesystemen.

MX met lange golflengte is zeer aantrekkelijk voor structuurbepaling door native ^{SAD-experimenten5,6} vanwege het gemak van het gebruik van kristallen rechtstreeks uit een succesvolle kristallisatieproef zonder verdere behandeling. Bovendien opent de toegang tot de absorptieranden van elementen van hoog biologisch belang, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor, de mogelijkheid om de posities van deze elementen in macromoleculen direct te identificeren7,8,9,10. Bij gemiddelde en lage resolutie kan elementtoewijzing op basis van de _2Fo-Fc elektronendichtheid en chemische omgeving moeilijk zijn, vooral voor elementen met een vergelijkbaar aantal elektronen of zwak gebonden ionen met gedeeltelijke bezetting. Deze dubbelzinnigheden kunnen worden opgelost door gegevens te verzamelen onder en boven de absorptierand van het element van belang en interpretatie van het resulterende model-gefaseerde abnormale verschil ^{Fourierkaarten11,12}. Het lokaliseren van zwavelatoomposities in deze kaarten kan ook helpen bij het bouwen van modellen in kaarten met een lage resolutie ^{elektronendichtheid13}. De absorptieranden van deze lichtelementen worden waargenomen bij golflengten tussen λ = 3 en 6 Å (zie figuur 1, boven). Dit golflengtebereik is veel groter geweest dan de mogelijkheden van elke synchrotron MX-bundellijn, en efficiënte werking in dit bereik vereist het overwinnen van verschillende technische uitdagingen, zoals hieronder beschreven.

Beamline I23 bij Diamond Light Source, VK, is een uniek instrument, speciaal ontworpen om MX-experimenten met lange golflengten mogelijk te maken, afstembaar in een golflengtebereik tussen λ = 1,13 en 5,9 Å (energiebereik tussen E = 2,1 en 11 keV). Door te werken in een omgeving met een hoog ^vacuüm14 worden luchtabsorptie en verstrooiing geëlimineerd, waardoor de efficiëntie van diffractie-experimenten en de signaal-ruisverhouding worden verbeterd. Een groot vacuümeindstation omsluit alle componenten van de monsteromgeving, inclusief de semi-cilindrische Pilatus 12M-detector, een meerassige goniometer, de online kijk- en collimatiesystemen, evenals de op maat gemaakte apparatuur voor monsteroverdracht en opslag (figuur 2). Elk apparaat is geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de beste kwaliteit lange golflengtegegevens kunnen worden verzameld. De gebogen Pilatus 12M detector kan diffractiehoeken van 2θ = ±100° verzamelen, wat resulteert in voldoende hoge resolutie diffractiegegevens, zelfs op de langste golflengten (figuur 1, onder). De 120 detectormodules zijn specifiek geselecteerd voor compatibiliteit met lage energie en er zijn kalibraties voor een extra ultrahoge versterkingsmodus geleverd.

De laagst mogelijke detectordrempel is 1,8 keV, wat leidt tot verhoogde hoek- en randeffecten voor energieën lager dan 3,6 keV en gecompromitteerde gegevenskwaliteit op de langste golflengten, met name voor kristallen met een lage mozaïekdichtheid, kan worden waargenomen. Dit effect in combinatie met de afname van de kwantumefficiëntie van de ^detector15 moet in aanmerking worden genomen bij het plannen van een experiment. De meerassige goniometer maakt heroriëntatie van kristallen mogelijk om strategieën voor gegevensverzameling mogelijk te maken die de kwaliteit en sterkte van het afwijkende signaal maximaliseren, evenals de volledigheid van de verzamelde abnormale gegevens. Monsterabsorptie is een beperkende factor voor de experimenten, vooral op de langste golflengten. Absorptiecorrecties, zoals geïmplementeerd in veelgebruikte MX-verwerkingssoftwarepakketten16,17, werken goed tot golflengten rond 3 Å. Langere golflengten vereisen analytische absorptiecorrecties op basis van tomografische ^{reconstructies18} of laserablatie om niet-diffracterend materiaal te verwijderen en de kristallen in goed gedefinieerde vormen te ^snijden19. Dit laatste zal ook helpen bij het verkleinen van grotere kristallen, omdat röntgendiffractie-experimenten op langere golflengten efficiënter zijn voor kleinere ^kristallen14. De uitdaging om monsters tijdens het verzamelen van gegevens bij cryogene temperaturen te houden, wordt aangepakt door geleidende koeling, omdat het gebruik van open-flow koude gasstroomapparaten niet compatibel is met een vacuümomgeving. Daarom zijn thermisch geleidende materialen, zoals koper, nodig voor het aansluiten van het monster op een cryocooler met pulsbuis. De roestvrijstalen SPINE-standaardpennen die in mx worden gebruikt, evenals andere in de handel verkrijgbare monsterbevestigingen, zijn niet geschikt voor mx met lange golflengte in vacuüm vanwege hun slechte thermische geleidbaarheid.

De monsterhouders (SHs) voor mx in vacuüm moeten een essentieel onderdeel zijn van de thermische warmteafvoerroute (figuur 3A). Als zodanig bestaan ze uit een thermisch geleidend koperen lichaam en pin en bevatten ze twee belangrijke kenmerken: een sterke magneetbasis om een adequate thermische verbinding met de koude goniometerkop te garanderen, en een monsterbevestiging, gemaakt van polyimide, om röntgenabsorptie en verstrooiing te ^{minimaliseren20}. Er werden inspanningen geleverd om ervoor te zorgen dat de gebruikerservaring van kristaloogst en flash-koeling bijna identiek is aan die van standaard MX-praktijken. Omdat de speciale I23 SF’s niet direct compatibel zijn met andere synchrotronbundellijnen, wordt een roestvrijstalen adapter gebruikt voor compatibiliteit met de kristaloogst magnetische staven en bestaande goniometerinterfaces op andere MX-beamlines (figuur 3B). De adapter is ook belangrijk voor het gebruik van de automatiseringsfaciliteiten op andere Diamond MX-beamlines, die zijn gebaseerd op ROBOTGRIJPERKOPPEN21 van het ALS-type en ongekuipingsachtige basislay-outs22, als monstervariatie een snelle voorscreening vereist voor selectie van de beste diffracterende kristallen. Het protocol voor monstervoorbereiding en -laden kan worden onderverdeeld in twee fasen:

Fase 1: Het oogsten van kristallen en het flashvriezen uitgevoerd door gebruikers in hun eigen laboratoria

Na beoordeling van de geschiktheid van het project voor I23-gegevensverzameling, worden monsterhouders met lussen die overeenkomen met de kristalgroottes (voorgemonteerd met adapters) naar gebruikerslaboratoria gestuurd voor kristaloogst. Om schade te voorkomen, mogen SF’s en adapters niet worden gescheiden en moeten ze als één eenheid worden gebruikt voor het vissen op kristallen met lussen van de juiste grootte met behulp van standaard magnetische staven voor het oogsten van kristallen. Zoals gebruikelijk in MX, wordt deze taak handmatig uitgevoerd onder de microscoop en worden kristallen onmiddellijk geflitst in een schuimdewar met vloeibare ^stikstof23. Door een mismatch van magnetische krachten zijn de SF’s momenteel niet compatibel met unipucks. Opslag en verzending worden gerealiseerd met behulp van combipucks (zie de tabel met materialen), die op verzoek beschikbaar zijn voor gebruikers, samen met de compatibele droge verzender inzetstukken (figuur 3C). Deze pucks delen dezelfde basisplaat met de veel gebruikte unipucks en maken een snelle voorscreening van monsters bij andere Diamond MX-beamlines mogelijk. Het uitlenen van deze apparatuur aan gebruikers is momenteel de beste regeling, totdat de op maat gemaakte monsterhouders commercieel beschikbaar zijn. Transport naar de beamline vereist de standaard droge verladers die in de MX-gemeenschap worden gebruikt.

Fase 2: Overdracht van cryogekoelde monsters naar het vacuümeindstation

Zodra de monsters op de bundellijn aankomen, worden ze voorbereid voor overdracht naar het vacuümeindstation. Dit omvat het verwijderen van SHs uit combipucks en scheiding van adapters. Het introduceren van biologische monsters om te vacuüm wordt routinematig uitgevoerd op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie. Enkele van de gevestigde concepten werden aangepast voor de I23-monsteroverdracht. Kortom, SF’s worden onder vloeibare stikstof overgebracht op transferblokken (figuur 3D). Deze blokken hebben een uitstekende thermische geleidbaarheid en een aanzienlijke thermische massa, waardoor de kristallen in vacuüm niet de glasovergangstemperatuur bereiken. Maximaal vier blokken, met elk een capaciteit van vier monsters, worden onder vloeibare stikstof in een blokpuck geladen (figuur 3H), die wordt gebruikt voor het overbrengen van monsters naar het cryogene overdrachtssysteem (CTS) of voor opslag in vloeibare stikstofdewars tussen experimenten.

Het cryogene overdrachtssysteem dat bij Diamond Light Source is ontwikkeld, bestaat uit twee subassemblages, het monsterstation en de shuttle (figuur 4A). Het Sample Station bestaat uit een bad met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag van eiwitkristallen en heeft specifieke kenmerken om de veiligheid te waarborgen en een gebruiksvriendelijke ervaring mogelijk te maken (figuur 5). De CTS wordt bestuurd door een programmeerbare logische controller via een gebruiksvriendelijke touchscreen-interface. Het sample station heeft ingebouwde lichtgevende diodes voor een betere visualisatie en een set kachels die in close-loop worden geregeld om het drogen van het vloeibare stikstofbad te automatiseren zodra de monsters zijn overgebracht. Het heeft ook een verscheidenheid aan sensoren om de veiligheid en efficiënte werking van het systeem te garanderen. Het sample station heeft op maat gemaakte hardware om een betrouwbare elektrische interface te bieden voor interactie met de shuttle voor bewerkingen, zoals pompen naar ruw vacuüm voor monsteroverdracht, evenals monitoring van vloeibare stikstofniveaus en de temperatuur in de shuttle.

De Shuttle (figuur 6) is een draagbaar apparaat dat wordt gebruikt om een overdrachtsblok van het vloeibare stikstofbad van het monsterstation op te pakken en over te brengen in een cryogene en vacuümomgeving naar het eindstation. Het omvat een vloeibare stikstof dewar om de monsters koud te houden tijdens de overdracht, vloeistofniveaubewaking in de dewar en een verscheidenheid aan sensoren voor werking en gebruikersveiligheid. De transferarm is uitgerust met een magnetische aandrijving en bevat bewerkte groeven om gebruikers te begeleiden bij het veilig laden en lossen van transferblokken in het eindstation. De overdracht van de shuttle naar het vacuümvat verloopt via een luchtsluis. De luchtsluis is een interface voor de shuttle op het eindstation die wordt gebruikt om de tussenruimte tussen de shuttle en het eindstation te evacueren, voordat de shuttle- en eindstationvacuümkleppen worden geopend. De pomp- en ontluchtingssequenties zijn volledig geautomatiseerd en kunnen worden bediend via een groot touchscreen met een gebruiksvriendelijke interface (figuur 4C). Het huidige protocol wordt gebruikt om een thaumatinekristal over te brengen naar het vacuümeindstation voor gegevensverzameling.