Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Langwellige Röntgenbeugung wird verwendet, um die anomalen Streueigenschaften bestimmter Lichtatome zu nutzen, die nativ in Makromolekülen vorhanden sind. Dies hilft, das kristallographische Phasenproblem zu lösen und die Identität und Lage solcher Elemente innerhalb von Makromolekülen eindeutig zu bestätigen. Während in den frühen Tagen der makromolekularen Kristallographie De-novo-Strukturen durch multiplen isomorphen ^Ersatz1 gelöst wurden, sind mit dem Aufkommen abstimmbarer Röntgenstrahllinien an Synchrotrons experimentelle Phasen, die auf anomalen Beugungstechniken mit mehreren Wellenlängen und Einzelwellenlängen (SAD) basieren, zu den dominierenden Methoden ^geworden2 . Beide Methoden stützten sich in der Vergangenheit auf das isomorphe oder anomale Signal von Schwermetallen, die künstlich durch Mitkristallisation oder Kristalleinweichen in die Kristalle eingebracht werden ^müssen3. Der Trial-and-Error-Ansatz und das unvorhersehbare Ergebnis können diese Experimente frustrierend zeitaufwendig machen. Der Einbau von Seleno-Methionin während der ^{Proteinexpression4} ist ein sehr eleganter Weg, um diese Einschränkungen zu überwinden und die anomale Beugung bei kurzen Wellenlängen auszunutzen, obwohl sie in eukaryotischen Proteinexpressionssystemen sehr schwierig sein kann.

Langwelliges MX ist äußerst attraktiv für die Strukturbestimmung durch native ^{SAD-Experimente5,6} aufgrund der Bequemlichkeit, Kristalle direkt aus einer erfolgreichen Kristallisationsstudie ohne weitere Behandlung zu verwenden. Darüber hinaus eröffnet der Zugang zu den Absorptionsrändern von Elementen von hoher biologischer Bedeutung wie Kalzium, Kalium, Chlor, Schwefel und Phosphor die Möglichkeit, die Positionen dieser Elemente in Makromolekülen direkt zu identifizieren7,8,9,10. Bei mittlerer und niedriger Auflösung kann die Elementzuordnung basierend auf der 2Fo-Fc-Elektronendichte und der chemischen Umgebung schwierig sein, insbesondere für Elemente mit ähnlicher Elektronenanzahl oder schwach gebundenen Ionen mit Teilbelegungen. Diese Mehrdeutigkeiten können gelöst werden, indem Daten unterhalb und oberhalb der Absorptionskante des interessierenden Elements gesammelt und die resultierende modellgestufte anomale Differenz interpretiert werden ^{Fourier-Karten11,12}. Die Lokalisierung von Schwefelatompositionen in diesen Karten kann auch die Modellbildung in Niedrigauflösungskarten für die Elektronendichte ^{unterstützen13}. Die Absorptionskanten dieser Lichtelemente werden bei Wellenlängen zwischen λ = 3 und 6 Å beobachtet (siehe Abbildung 1, oben). Dieser Wellenlängenbereich ging weit über die Fähigkeiten jeder Synchrotron-MX-Beamline hinaus, und ein effizienter Betrieb in diesem Bereich erfordert die Überwindung mehrerer technischer Herausforderungen, wie unten beschrieben.

Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, ist ein einzigartiges Instrument, das speziell für langwellige MX-Experimente entwickelt wurde und in einem Wellenlängenbereich zwischen λ = 1,13 und 5,9 Å (Energiebereich zwischen E = 2,1 und 11 keV) abstimmbar ist. Durch den Betrieb in einer Hochvakuumumgebung14 werden Luftabsorption und -streuung eliminiert, wodurch die Effizienz von Beugungsexperimenten und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert werden. Eine grosse Vakuum-Endstation umschließt alle Komponenten der Probenumgebung, einschliesslich des halbzylindrischen Pilatus 12M Detektors, eines Mehrachs-Goniometers, der Online-Sicht- und Kollimationssysteme sowie der massgeschneiderten Ausrüstung für probentransfer und -lagerung (Abbildung 2). Jedes Gerät wurde optimiert, um sicherzustellen, dass langwellige Daten in bester Qualität gesammelt werden können. Der gekrümmte Pilatus 12M Detektor kann Beugungswinkel von 2θ = ±100° sammeln, was zu ausreichend hochauflösenden Beugungsdaten auch bei längsten Wellenlängen führt (Abbildung 1, unten). Die 120 Detektormodule wurden speziell für die Niedrigenergiekompatibilität ausgewählt und Kalibrierungen für einen zusätzlichen Ultra-High-Gain-Modus wurden bereitgestellt.

Die niedrigstmögliche Detektorschwelle beträgt 1,8 keV, was zu erhöhten Ecken- und Kanteneffekten für Energien unter 3,6 keV führt und eine beeinträchtigte Datenqualität bei den längsten Wellenlängen, insbesondere für Kristalle mit geringer Mosaikität, beobachtet werden kann. Dieser Effekt in Kombination mit der Abnahme der Quanteneffizienz des ^Detektors15 muss bei der Planung eines Experiments berücksichtigt werden. Das mehrachsige Goniometer ermöglicht die Neuausrichtung der Kristalle, um Datenerfassungsstrategien zu ermöglichen, die die Qualität und Stärke des anomalen Signals sowie die Vollständigkeit der gesammelten anomalen Daten maximieren. Die Probenabsorption ist ein limitierender Faktor für die Experimente, insbesondere bei längsten Wellenlängen. Absorptionskorrekturen, wie sie in häufig verwendeten MX-Verarbeitungssoftwarepaketen16,17 implementiert sind, funktionieren gut bei Wellenlängen um 3 Å. Längere Wellenlängen erfordern analytische Absorptionskorrekturen auf der Grundlage tomographischer ^{Rekonstruktionen18} oder Laserablation, um nicht entschärfendes Material zu entfernen und die Kristalle in genau definierte Formen zu ^schneiden19. Letzteres wird auch dazu beitragen, die Größe größerer Kristalle zu reduzieren, da Röntgenbeugungsexperimente bei längeren Wellenlängen für kleinere Kristalle effizienter ^sind14. Die Herausforderung, Proben während der Datenerfassung bei kryogenen Temperaturen zu halten, wird durch leitfähige Kühlung angegangen, da die Verwendung von Kaltgasstromgeräten mit offenem Durchfluss nicht mit einer Vakuumumgebung kompatibel ist. Daher werden wärmeleitfähige Materialien wie Kupfer benötigt, um die Probe mit einem Pulsrohr-Kryokühler zu verbinden. Die SPINE-Standardstifte aus Edelstahl, die in der gesamten MX verwendet werden, sowie alle anderen handelsüblichen Probenhalterungen sind aufgrund ihrer schlechten Wärmeleitfähigkeit nicht für langwellige MX im Vakuum geeignet.

Die Probenhalter (SHs) für MX im Vakuum müssen ein wesentlicher Bestandteil des Wärmeabfuhr-Wärmeweges sein (Abbildung 3A). Als solche bestehen sie aus einem wärmeleitfähigen Kupferkörper und einem Stift und verfügen über zwei wichtige Merkmale: eine starke Magnetbasis, um eine ausreichende thermische Verbindung zum Kalten Goniometerkopf zu gewährleisten, und eine Probenhalterung aus Polyimid, um die Röntgenabsorption und -streuung zu ^minimieren20. Es wurden Anstrengungen unternommen, um sicherzustellen, dass die Benutzererfahrung bei der Kristallernte und Flash-Kühlung fast identisch mit der mit Standard-MX-Praktiken verbunden ist. Da die dedizierten I23-SHs nicht direkt mit anderen Synchrotron-Beamlines kompatibel sind, wird ein Edelstahladapter für die Kompatibilität mit den kristallgewinnenden Magnetstäben und vorhandenen Goniometer-Schnittstellen an anderen MX-Beamlines verwendet (Abbildung 3B). Der Adapter ist auch wichtig, um die Automatisierungsfunktionen anderer Diamond MX-Beamlines zu nutzen, die auf ALS-Robotergreiferköpfen21 und Unipuck-Basislayouts22 basieren, wenn Probenvariationen eine schnelle Vorabsiebung zur Auswahl der besten Gebeugungskristalle erfordern. Das Probenvorbereitungs- und Ladeprotokoll kann in zwei Stufen unterteilt werden:

Stufe 1: Ernte von Kristallen und Schockgefrieren durch Benutzer in ihren eigenen Labors

Nach Der Beurteilung der Eignung des Projekts für die I23-Datenerfassung werden Probenhalter mit Schleifen, die den Kristallgrößen entsprechen (mit Adaptern vormontiert), zur Kristallgewinnung an die Benutzerlabore geschickt. Um Schäden zu vermeiden, sollten SHs und Adapter nicht getrennt werden und sind als eine Einheit zu verwenden, um Kristalle mit entsprechend großen Schleifen mit Standard-Kristallernte-Magnetstäben zu fischen. Wie bei MX üblich, wird diese Aufgabe manuell unter dem Mikroskop durchgeführt und Kristalle werden sofort in einem Schaumentwar mit flüssigem Stickstoff ^gekühlt23. Aufgrund eines Missverhältnisses der magnetischen Kräfte sind die SHs derzeit nicht mit Unipucks kompatibel. Die Lagerung und der Versand erfolgen über Combipucks (siehe Materialtabelle), die den Anwendern auf Anfrage zusammen mit den kompatiblen Dry Shipper-Einsätzen zur Verfügung stehen (Abbildung 3C). Diese Pucks teilen sich die gleiche Grundplatte mit den weit verbreiteten Unipucks und ermöglichen ein schnelles Pre-Screening von Proben an anderen Diamond MX-Beamlines. Die Ausleihe dieser Geräte an Benutzer ist derzeit die beste Vereinbarung, bis die maßgeschneiderten Probenhalter im Handel erhältlich sind. Der Transport zur Beamline erfordert die Standard-Trockenverlader, die in der MX-Community eingesetzt werden.

Stufe 2: Transfer von kryogekühlten Proben in die Vakuumendstation

Sobald die Proben auf der Beamline ankommen, werden sie für den Transfer in die Vakuumendstation vorbereitet. Dies beinhaltet die Entfernung von SHs aus Combipucks und die Trennung von Adaptern. Die Einführung biologischer Proben in das Vakuum wird routinemäßig auf dem Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie durchgeführt. Einige der etablierten Konzepte wurden für den I23-Probentransfer adaptiert. Kurz gesagt, SHs werden unter flüssigem Stickstoff auf Transferblöcke übertragen (Abbildung 3D). Diese Blöcke haben eine ausgezeichnete Wärmeleitfähigkeit und eine signifikante thermische Masse, die verhindert, dass die Kristalle im Vakuum die Glasübergangstemperatur erreichen. Bis zu vier Blöcke mit einer Kapazität von jeweils vier Proben werden unter flüssigem Stickstoff in einen Block puck geladen (Abbildung 3H), der entweder für den Transfer von Proben in das Cryogenic Transfer System (CTS) oder für die Lagerung in flüssigen Stickstoff-Dewars zwischen den Experimenten verwendet wird.

Das an der Diamond Light Source entwickelte Kryotransfersystem besteht aus zwei Unterbaugruppen, der Probenstation und dem Shuttle (Abbildung 4A). Die Probenstation besteht aus einem Flüssigstickstoffbad zur Zwischenlagerung von Proteinkristallen und verfügt über spezifische Merkmale, um die Sicherheit zu gewährleisten und ein benutzerfreundliches Erlebnis zu ermöglichen (Abbildung 5). Das CTS wird von einer speicherprogrammierbaren Steuerung über eine benutzerfreundliche Touchscreen-Oberfläche gesteuert. Die Probenstation verfügt über eingebaute Leuchtdioden für eine bessere Visualisierung und eine Reihe von Heizungen, die in einem geschlossenen Regelkreis gesteuert werden, um die Trocknung des Flüssigstickstoffbades nach dem Transfer der Proben zu automatisieren. Es verfügt auch über eine Vielzahl von Sensoren, um die Sicherheit und das effiziente Funktionieren des Systems zu gewährleisten. Die Probenstation verfügt über maßgeschneiderte Hardware, um eine zuverlässige elektrische Schnittstelle für die Interaktion mit dem Shuttle für Operationen bereitzustellen, z. B. das Pumpen in grobes Vakuum für den Probentransfer sowie die Überwachung des Gehalts an flüssigem Stickstoff und der Temperatur im Inneren des Shuttles.

Das Shuttle (Abbildung 6) ist ein tragbares Gerät, das verwendet wird, um einen Transferblock aus dem Flüssigstickstoffbad der Probenstation aufzunehmen und ihn in einer kryogenen und Vakuumumgebung zur Endstation zu übertragen. Es enthält einen Flüssigstickstoff-Dewar, um die Proben während des Transfers kalt zu halten, eine Flüssigkeitsstandüberwachung im Dewar und eine Vielzahl von Sensoren für die Betriebs- und Benutzersicherheit. Der Transferarm ist mit einem Magnetantrieb ausgestattet und verfügt über bearbeitete Nuten, die den Benutzer beim sicheren Be- und Entladen von Transferblöcken in die Endstation unterstützen. Der Transfer vom Shuttle zum Vakuumbehälter erfolgt über eine Luftschleuse. Die Luftschleuse ist eine Schnittstelle für das Shuttle auf der Endstation, die verwendet wird, um den Zwischenraum zwischen dem Shuttle und der Endstation zu evakuieren, bevor die Shuttle- und Endstationsvakuumventile geöffnet werden. Die Pump- und Entlüftungsabläufe sind vollautomatisch und können über einen großen Touchscreen mit benutzerfreundlicher Oberfläche bedient werden (Abbildung 4C). Das aktuelle Protokoll wird verwendet, um einen Thaumatin-Kristall zur Datenerfassung an die Vakuumendstation zu übertragen.